興奮劑檢測

  
在體育比賽中，有些運動(dòng)員為了爭取取得好名次、提高成績(jì)，常服用一些藥物，企圖憑借藥物作用獲得榮譽(yù)。這種做法損害了體育運動(dòng)的本來(lái)目的，也違反了奧林匹克公平競賽的原則。同時(shí)，因藥物的毒副作用嚴重地威脅著(zhù)運動(dòng)員的身體健康，國際奧委會(huì )（IOC）明文規定禁止運動(dòng)員服用某些藥物，并自1968年起在奧運會(huì )比賽中對運動(dòng)員進(jìn)行“濫用藥物”的檢測，若查出他已服用，便立即取消其參賽資格及所得名次。由于最早服用的藥物多為興奮性藥物——刺激劑類(lèi)，所以盡管以后也禁用了其他類(lèi)型的藥物，但在我國則常常將所有的禁用藥物統稱(chēng)為“興奮劑”，有關(guān)的檢測工作則統稱(chēng)為“興奮劑檢測”。正確的叫法應為“濫用藥物”及“濫用藥物檢測”，分別對應于英文“doping”和“doping control”。為方便起見(jiàn)，本文仍使用“興奮劑”一詞，即包括所有的禁用的濫用藥物?！?nbsp;

一 服用藥物歷史

在競賽中服用各種物質(zhì)以求獲得優(yōu)勢的做法已有多年歷史。早在公元前600年，古羅馬的斗士就使用過(guò)刺激劑。公元前3世紀，希臘人也曾服用過(guò)蘑菇以求提高成績(jì)。19世紀80年代在法國的自行車(chē)600km比賽中發(fā)生過(guò)運動(dòng)員因服用藥物而死亡。1910年已開(kāi)始對參賽馬匹的唾液進(jìn)行藥物檢查。在1960年，羅馬奧運會(huì )上發(fā)生了丹麥自行車(chē)運動(dòng)員Kurt EnemarKnud Jensen因服用苯丙胺類(lèi)而死亡的事件。在1967年，環(huán)法自行車(chē)賽中英國的運動(dòng)員Tommy Simpson也因服用苯丙胺藥物而喪生。這些事件促使了國際奧委會(huì )醫學(xué)委員會(huì )對1968年第19屆奧運會(huì )開(kāi)始實(shí)行藥物檢查。當時(shí)禁用的藥物只有8種，檢測方法是氣相色譜（氫焰離子化檢測器）法和薄層色譜法等。1972年第20屆奧運會(huì )時(shí)，禁用藥物增加至26種，檢測儀器采用氣相色譜-氮磷檢測器。1976年，又增加了甾體同化激素一類(lèi)5種禁用藥物，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器。1980年公布的禁用藥物為58種，開(kāi)始采用毛細管氣相色譜法檢測。其后1984年增至69種。1988年再增加β-阻斷劑和利尿劑類(lèi)藥物，總數達100種。1991年增加一類(lèi)多肽，1994年12月IOC公布的禁用藥物共分為七類(lèi)，計108種。有關(guān)歷屆奧運會(huì )檢測運動(dòng)員數目及陽(yáng)性結果列于表1。

表1　 歷屆奧運會(huì )的藥物檢測結果


*其中1金牌，1銀牌，2銅牌子　 **其中3金牌，1銅牌

二 禁用藥物

1995年禁用的藥物，按其性質(zhì)可分為7類(lèi)（見(jiàn)表2），分述如下：

表2禁用藥品名單（1994，12）

注意：該表并非禁用物質(zhì)的詳盡無(wú)遺的一覽表。僅向讀者提供一個(gè)較為綜合的禁用物質(zhì)一覽表，于該擴展表中沒(méi)有出現的許多物質(zhì)按“及相關(guān)物質(zhì)”術(shù)語(yǔ)被認為禁用。




　


  

1.刺激劑 這類(lèi)藥物共有41種。它們通過(guò)神經(jīng)系統的作用，增強人的精神與體力。其副作用是導致過(guò)度興奮與焦慮，進(jìn)一步影響判斷力而容易受傷，心率及血壓會(huì )急速上升，有可能造成脫水、腦溢血及心臟病發(fā)作。上述兩例運動(dòng)員的死亡就是服用這類(lèi)藥物引起的。這類(lèi)藥物中含咖啡因，奧委會(huì )規定尿中咖啡因含量超過(guò)12μg/ml才算違禁。

2.麻醉劑 這類(lèi)藥物共有10種。服用后可產(chǎn)生痛快感及心理亢奮，并能降低痛感，以致在參賽中造成更嚴重的傷害。這類(lèi)藥物多有成癮性，會(huì )引起很多生理及心理問(wèn)題。

3.合成類(lèi)固醇及β2激動(dòng)劑 這類(lèi)藥物共27種。合成類(lèi)固醇又稱(chēng)甾體同化激素，是雄性激素衍生物。這類(lèi)藥物具有增長(cháng)肌肉的作用，為很多運動(dòng)員口服或注射使用，但副作用也很?chē)乐?，?huì )干擾人體的自然激素平衡，男人服用后會(huì )發(fā)生抑制雄性激素分泌，睪丸縮小，胸部擴大，早禿等現象；女人服用后，會(huì )發(fā)生男性化，肌肉增生，月經(jīng)失調，毛發(fā)增多等現象。有些作用還是不可逆的。過(guò)多地使用這類(lèi)藥物還會(huì )引起嚴重的肝、腎損傷、并發(fā)肝癌及心臟病癥等。這類(lèi)藥物中的睪酮是人體自然分泌的一種激素，所以規定要測定睪酮與其異構體表睪酮之比值，大于6時(shí)可判斷為使用了此類(lèi)藥物。另有幾種β2激動(dòng)劑，據認為也有類(lèi)似作用。

4.β-阻斷劑 這類(lèi)藥物共有12種。原為降低血壓和降低心率的藥物，但同時(shí)具有鎮靜作用。對于射擊、射箭等項目的運動(dòng)員，穩定神經(jīng)，提高成績(jì)。

5.利尿劑 共13種。這類(lèi)藥物會(huì )促進(jìn)排尿，使尿液變稀，使禁用藥物在尿中的濃度減小而不易查出。還可使體重下降，因此在一些有體重限制的比賽項目中常有運動(dòng)員服用。

6.遮蔽劑 共2種。表睪酮是因為使用后可使睪酮與表睪酮的比值變小，從而遮蔽了睪酮的違禁使用。另一藥物丙磺舒則在服用后可抑制合成類(lèi)固醇類(lèi)藥物在尿中的排出，因而使此類(lèi)藥物在尿中的濃度降低，可能不被檢出。

7.肽類(lèi)激素 共4種。都是內源性激素，使用后或可起到雄性激素作用，或可增加身體耐力，因而也被禁用。

禁用藥物除去上述這些品種外，還包括結構和性質(zhì)與這些藥物相似的物質(zhì)，所以實(shí)際禁用藥物決不限于已列出的這些，會(huì )大大超過(guò)這個(gè)數目。這些類(lèi)似的藥物都做為“有關(guān)化合物”，也是禁用的，是為了防止運動(dòng)員取巧，服用新發(fā)明的某些藥物?！?nbsp;

檢測手續

興奮劑檢測都是通過(guò)尿樣的分析來(lái)進(jìn)行的。被檢查的運動(dòng)員一般是獲得了名次的，對未獲名次的則是隨機選擇。比賽結束后一個(gè)小時(shí)內，被選中的運動(dòng)員需去取樣站報到，有專(zhuān)人伴隨左右，直至取得尿樣為止。一般需取尿樣至少75ml，分裝兩個(gè)瓶?jì)?，一瓶裝約50ml，稱(chēng)為A樣，另一瓶裝25ml，稱(chēng)為B樣。將A樣與B樣密封、編號，再裝入一個(gè)袋中，密封，冷凍保存，送往檢測中心分析。在分析時(shí)，先用A樣進(jìn)行，應在24小時(shí)內得出結果，如查出尿樣中有禁用藥物，則由檢測中心通知組織委員會(huì )，再通知運動(dòng)員及其所在體育隊隊長(cháng)、隊醫。大家會(huì )同當面取出B樣再進(jìn)行分析復審，如仍檢測出有禁用藥物，則由醫學(xué)委員會(huì )討論決定采取措施。

由于服用藥物影響運動(dòng)員的聲譽(yù)，所以檢測工作要求極嚴格，并采取嚴密的保安措施，以防止各種弄虛作假的欺騙行為?！?nbsp;

四 檢測實(shí)驗室的資格

對檢測興奮劑的實(shí)驗室，國際奧委會(huì )有一套規定的申請手續與方法，經(jīng)測試合格后，才有資格進(jìn)行這項工作，其所發(fā)出的分析結果報告才被認為有效?，F在的規定是：如欲承擔某國際性比賽的興奮劑檢測，必須在比賽前一年通過(guò)正式考試，而在參加正式考試前的半年至一年內，要先通過(guò)3次預考試。每次考試須分析10個(gè)未知尿，并在24小時(shí)內得出正確結果。如有一個(gè)不正確，須重新補做2個(gè)未知樣品并得出正確結果。如只做對7個(gè)考試尿樣，則作不及格論，須過(guò)一年后再行申請考試。

考試合格的實(shí)驗室的有效工作期限為一年，翌年初須進(jìn)行復核。復核時(shí)要分析8個(gè)未知尿樣，并得出正確結果，做錯1個(gè)時(shí)，可補加2個(gè)未知樣品。如上所述，如復核不能通過(guò)，則該實(shí)驗室的檢測資格即被取消。

國際奧委會(huì )醫學(xué)委員會(huì )對申請興奮劑檢測資格考試的實(shí)驗室首先要對其人員組成、業(yè)務(wù)能力、過(guò)去成就、實(shí)驗室設備、所用興奮劑檢測方法、禁用藥物標準品、禁用藥物陽(yáng)性尿、原型藥物和必要的代謝物的氣相色譜和質(zhì)譜數據等等進(jìn)行審查，認為合格后才同意其申請。較困難的是標準品的收集和陽(yáng)性尿的取得，因為禁用藥物是世界各地生產(chǎn)的、需通過(guò)多種渠道才能收集完全；有些藥物還需要特殊許可才可攜帶或運輸郵寄。陽(yáng)性尿的取得則要有自愿服用這些藥物的人按時(shí)收集尿液，作為檢測時(shí)的對照標準。除了用運動(dòng)員的尿樣分析結果來(lái)確證其是否服用某藥物外，同時(shí)要有此藥物的標準品、陽(yáng)性尿和空白尿的色譜和質(zhì)譜圖譜，共同對照比較。當尿樣與標準品和陽(yáng)性尿的數據完全相同時(shí)才可確證?！?

五 檢測步驟

尿樣由專(zhuān)人送至檢測實(shí)驗室后，需登記、編號，并測量某些基本數據，如pH、比重、顏色、體積及有無(wú)沉淀等。然后將尿樣分取數份，按組進(jìn)行篩選，若篩選中查出有違禁藥物，則需進(jìn)一步確證其存在。

色譜方法是較理想的檢測手段。1967年報道的刺激劑系統檢測方法分為三步：第一步為篩選，第二、三步為確證。用兩種提取方法以氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC）進(jìn)行分離鑒定，使用了4種GC填充柱系統，氫焰離子化檢測器，可檢出40種興奮劑。其后隨著(zhù)色譜技術(shù)的發(fā)展及禁用藥物的增加，檢測方法也相應地不斷改進(jìn)。1972年采用了程序升溫方法，并用氮磷檢測器檢測。1976年使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用手段檢測甾體，1980年開(kāi)始用毛細管氣相色譜法檢測，至1984年大體基本定型，并增加了用高效液相色譜法檢查幾種特定藥物及咖啡因定量等工作。1988年增加了2類(lèi)藥物，β-阻斷劑多用氣相色譜法檢出，利尿劑則用高效液相色譜法檢測。目前一般按興奮劑類(lèi)別分為4組或5組進(jìn)行。各實(shí)驗室所用方法的原理大同小異，具體試驗條件則根據自己的具體情況而有所不同。檢測的第一步是篩選，如未查出任何禁用藥物即做為陰性尿，不再考慮；如查出有禁用藥物存在，則仍需進(jìn)一步分析，稱(chēng)為“確證”?，F以我們在第十一屆亞運會(huì )所用的檢測方法為例，說(shuō)明如下：

1.篩選方法

尿樣送到試驗室后，分別取數毫升放小試管內，分交各組進(jìn)行篩選實(shí)驗。共分為：揮發(fā)性含氮化合物組、難揮發(fā)含氮化合物組、利尿劑及特殊結構化合物組、甾體同化激素組。

（1）揮發(fā)性含氮化合物組 主要檢測刺激劑。這類(lèi)藥物多以游離形式排出，其檢測流程如圖1，所用氣相色譜條件列于表3。

（2）難揮發(fā)含氮化合物組 主要檢測麻醉鎮痛劑和β-阻斷劑。這兩類(lèi)藥物多以結合形式排出，因此需先水解，使之游離，再進(jìn)行衍生化后檢測，其方法流程如圖2，色譜條件如表4所示。 

表3氣相色譜操作條件

表4 氣相色譜操作條件

（3）利尿劑組藥物經(jīng)提取后用高效液相色譜法分析檢測，此組同時(shí)檢測2種興奮劑，咖啡因和匹莫林，檢測程序和色譜條件分別見(jiàn)圖3和表5。

表5　 液相色譜操作條件

 

（4）甾體同化激素組 此類(lèi)藥物有的以游離形式，有的以結合形式排出，我們所用的方法為同時(shí)檢測。其流程和色譜條件如圖4和表6所示。

表6 氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件

2.確證方法

經(jīng)篩選判為陽(yáng)性的尿樣，需進(jìn)一步加以確證，根據規定，確證結果須給出藥物或其代謝物的質(zhì)譜圖，因此在確證方法中均使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，確證時(shí)的分組同篩選方法中所述。

（1）揮發(fā)性含氮化合物組方法同篩選，最后之提取物濃縮后進(jìn)樣于GC/MSD。色譜條件見(jiàn)表7。

表7　 氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件

  

（2）難揮發(fā)含氮化合物組方法同篩選，最后之衍生化產(chǎn)物取小量進(jìn)樣于GC/MSD。色譜條件見(jiàn)表8。

表8　 氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件
 
 

（3）利尿劑組此組藥物需衍生化，然后進(jìn)樣于GC/MSD。方法見(jiàn)圖5（a，b）色譜條件見(jiàn)表9。

表9氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件
 
 

（4）甾體同化激素組 方法均同篩選，唯最后得出全質(zhì)譜圖作為確證。

現代的興奮劑檢測實(shí)驗室多采用自動(dòng)化程度較高的儀器，并由計算機控制，可以自動(dòng)進(jìn)樣，提高準確性和重現性，并可編制檢測程序，大大方便了此項工作。

需要提出的是禁用藥物中的肽類(lèi)激素藥物是1990年以后才提出的，目前還沒(méi)有很好的檢測方法，同時(shí)因為它們都是人體內的內源性物質(zhì)，在分析方法和數據積累、限量等方面還需要做更多的工作才能訂出較合適的標準?！?nbsp;

六　 我國的興奮劑檢測工作

為迎接1990年第十一屆亞運會(huì )在北京召開(kāi)和承擔運動(dòng)員尿樣的檢測工作，于1986年9月由中國醫學(xué)科學(xué)院藥物研究所和國家體委體育科學(xué)研究所協(xié)作，共同籌建我國的興奮劑檢測中心。經(jīng)過(guò)三年的努力，1989年3月開(kāi)始，接受了IOC醫學(xué)委員會(huì )興奮劑和體育生化分委會(huì )的三次預考和兩次水平考試，共38個(gè)未知尿樣均獲得了準確結果，順利通過(guò)。于1989年11月正式考試，分析10個(gè)未知尿樣，又按時(shí)得出全部正確結果，同年12月8日，IOC副主席、IOC醫學(xué)委員會(huì )主席Alexandre de Merode親王寫(xiě)信給中國興奮劑檢測中心，正式通知確認其為合格的興奮劑檢測實(shí)驗室。因此我國成為當時(shí)世界上第20個(gè)、亞洲第3個(gè)合格的實(shí)驗室，可以獨立承擔各種運動(dòng)比賽的興奮劑檢測工作。此后每年復試也都合格，一直保持了此資格?，F在該檢測中心設在國家體委運動(dòng)醫學(xué)研究所內。