片上實(shí)驗室的新進(jìn)展

2004年8月A版

　　當前，半導體集成技術(shù)終于轉向了90nm線(xiàn)寬工藝，開(kāi)始進(jìn)入納米領(lǐng)域，預料今后將再發(fā)展65nm、45nm的細微加工技術(shù)，人類(lèi)擁有的細微加工技術(shù)將真正達到納米技術(shù)的水平。把這種納米技術(shù)應用到生物化學(xué)領(lǐng)域目前極受關(guān)注。

何謂片上實(shí)驗室

　　近年來(lái)，把科學(xué)的分析操作集成到像半導體集成電路那樣的幾個(gè)平方厘米的玻璃、硅或塑料等微型薄片上的研究正在蓬勃開(kāi)展，這在美國叫做片上實(shí)驗室(Lab-on-a-chip),在歐洲稱(chēng)為MTAS(Micro Total Analysis Systems,微型綜合分析系統)。它是指利用細微加工技術(shù)在玻璃或塑料基板上制作成溶液流動(dòng)的微小通道網(wǎng)絡(luò )，在一只芯片上集成如在實(shí)驗室進(jìn)行生化、化學(xué)操作和檢測。

　　由于其微小，必然具有樣本微量化、反應與分析高速化等多種優(yōu)點(diǎn)。其方法雖各有不同，但就其根本目的來(lái)說(shuō)，進(jìn)行的納米級的化學(xué)及生物高分子等的性質(zhì)和功能分析，或者對其人工合成與控制則是共通的。為此，今天已應用了納米技術(shù)。

片上實(shí)驗室與納米技術(shù)

　　關(guān)于應用納米技術(shù)及反應場(chǎng)微小的效果包括：①因擴散而易于產(chǎn)生混合，即反應場(chǎng)體積如為1/10，則擴散時(shí)間將縮短為1/100；②提高每單位體積的表面積比，這可望熱的進(jìn)出及表面-液體間的相互作用(包含催化劑化學(xué)反應等)高效化。③提高通道每單位截面積的周長(cháng)比；由于壁面與液體的粘著(zhù)力的影響比慣性力增加更大，故通道中的液體易形成層流。

　　目前主要是利用①、②效用研究通道中液體與液體界面化學(xué)處理，但如能通過(guò)納米表面結構加工等納米技術(shù)進(jìn)行控制，則可望利用②的效用，開(kāi)發(fā)固體、液體表面反應高效化的反應堆。此外，由于nm級的空間控制可實(shí)現微小空間的精密環(huán)境控制，故有可能發(fā)展如設計生物分子之類(lèi)的制作技術(shù)。

　　此外，如考慮到nm大小的蛋白質(zhì)或其集合體(生物分子機械、生物納米機)負有生命的功能，則必須測量單個(gè)分子或單分子機械的功能，直接觀(guān)察、操作這一測量的技術(shù)已在開(kāi)發(fā)中。

片上實(shí)驗室對染色體分析的必要性

　　包含人的遺傳基因信息的全部DNA信息(堿基系列)的人類(lèi)染色體排序已接近完成。人類(lèi)染色體計劃由于DNA排序技術(shù)的顯著(zhù)進(jìn)展，將比預定期限更短成功實(shí)現(圖1)。人類(lèi)已處于后染色體時(shí)代的起點(diǎn)。

　　即使在后染色體時(shí)代，染色體及DNA分析仍然重要。分析每個(gè)人染色體信息差異的SNP分析，分析比較人以外生命的染色體信息來(lái)深刻理解生命現象的比較染色體學(xué)等，都必須由龐大的樣本和信息進(jìn)行歸納或演繹分析，因此，更高速的DNA排序技術(shù)將是不可缺少的。近年來(lái)大受重視的按染色體制藥實(shí)現的定制式醫療，就需要各個(gè)人的染色體分析。

　　人染色體有約32億個(gè)堿基，1000人的染色體信息就會(huì )有3T個(gè)(T=1012)堿基，地球規模計人染色體信息將是18E(E=1018)的天文數字。要獲得這樣龐大的信息現有技術(shù)將受到限制，只有前所未有的嶄新技術(shù)才有望在后染色體排序時(shí)代發(fā)揮極為重要的作用。

　　作為把握下一代技術(shù)開(kāi)發(fā)關(guān)鍵的基礎技術(shù)，基于半導體技術(shù)的微納米技術(shù)與提取生命信息的濕化學(xué)技術(shù)的結合、陣列排布和集成最為重要，片上實(shí)驗室在目的及技術(shù)方面將是所追求的，也必將應用于染色體分析。在這一背景下，便出現了應用細微加工技術(shù)的DNA芯片及電泳芯片等獨特的微芯片DNA分析技術(shù)。

DNA芯片與微陣列

　　DNA芯片是把序列各異的許多(幾千至數萬(wàn)種)DNA片斷排列固定在玻璃或硅基片上，以預先用螢光試劑標準化的DNA樣本擦該芯片，利用作成DNA互補的雙層螺旋狀的性質(zhì)，用激光束檢測樣本DNA與DNA芯片上的某種DNA是否產(chǎn)生相互作用(雜混)。

　　DNA在芯片上的固定大致分為化學(xué)結合型和定位型兩類(lèi)。通常，把化學(xué)結合型叫做DNA芯片，而把定位型叫做微陣列。

　　DNA芯片及微陣列最重要的應用領(lǐng)域是遺傳基因的顯現分析。在人染色全中，遺傳基因總共有3~4萬(wàn)種，其中實(shí)際起作用(顯現)的遺傳基因只有一部分，而且不同的細胞其顯現遺傳基因不一樣。比如，比較癌細胞與正常細胞，若研究癌細胞中經(jīng)常顯現的遺傳基因或不顯現的遺傳基因，其中就應該有把握致癌機理關(guān)鍵并成為治療對象的遺傳基因。若知道遺傳基因，便可望大規模進(jìn)行疾患的診斷和治療了。

　　遺傳基因顯現分析情況下，要知道遺傳基因的顯現，必須知道顯現生成的RNA(傳遞核糖核酸)。首先從細胞中取出mRNA，利用逆復寫(xiě)反應配制加入了螢光標識的目標cDNA(互補DNA)。將該cDNA雜混在微陣列中，使可用螢光成像分析器檢測出來(lái)。例如，根據人癌細胞與正常細胞的微陣列分析結果，可以發(fā)現兩種細胞間遺傳基因顯現量的不同，通過(guò)對它們的數據庫檢索，便能發(fā)現癌細胞中經(jīng)常顯現的遺傳基因。

微芯片電泳

　　DNA的排序方法一般采用圣伽法。圣伽法中DNA片斷的分離最初通過(guò)平板型聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)現。它是在兩塊玻璃板間用凝膠作隔離物。但是在人染色體計劃中，取代該分離法利用毛細管電泳進(jìn)行處理，實(shí)現了處理速度的飛躍提高。

　　現在還開(kāi)發(fā)了在微芯片上的通道中實(shí)現染色體排序的技術(shù)，證明20分鐘即能實(shí)現每個(gè)通道中解讀600堿基的遺傳信息。此種微芯片排序器能達到現有DNA分析設備1000倍以上的高速度，是一種極具魅力的新技術(shù)。

　　圖2示出微芯片電泳的概念。首先，在所有流路及各貯液槽(圖2中a凝膠貯液槽)中注入泳動(dòng)緩沖液。其后在樣本貯液槽中加入樣本，如圖2(b)加上電壓，在幾十秒內樣本DNA將均勻充滿(mǎn)樣本引入流路。然后如切換所加電壓(圖2(c))，存在于流路接頭部的一定量的樣本將移動(dòng)到分離流路，利用電泳進(jìn)行分離、檢測。此時(shí)，由于留在樣本引入流路內的剩余樣本遠離流路接頭部，對外部的貯液槽仍加正電壓，如圖2(d)。

　　圖2右邊是使用了3種DNA混合溶液對該樣本引入情況的成像。在樣本引入1秒鐘后DNA呈極尖銳的的帶狀進(jìn)入分離通道，到6秒鐘后便看到3種DNA帶狀物開(kāi)始分離，由于這種樣本引入法的采用，與毛細管電泳不一樣，能達到定量的樣本引入。

DNA單分子分析的挑戰

　　利用微芯片電泳之各種方法雖能進(jìn)行DNA排序的高速化，但如考慮將來(lái)染色體醫療等后染色體研究(參見(jiàn)圖1)，必須有提取龐大達E級的堿基序列信息的排序技術(shù)。為實(shí)現DNA排序的全新高速化，正在挑戰DNA單分子分析，目前雖在研究階段，但研究甚為活躍。試舉意味深品的一例。

　　據哈佛大學(xué)的Branton等稱(chēng)，已試驗過(guò)DNA單分子通過(guò)納米的排序，由D-溶血素葡萄球菌的蛋白質(zhì)毒素)自身作用形成直徑1.4nm的納米孔，在具有此種納米孔通道的脂質(zhì)雙層膜兩邊加電壓，此時(shí)電解質(zhì)在溶液中溶解，由于通過(guò)納米孔的離子傳導，便有微微安級電流流過(guò)。當帶負電的DNA分子被拉向陽(yáng)極時(shí)，堵塞了作為離子通道的納米孔，離子傳導受到限制，從而檢測出電流值的改變。

　　根據通過(guò)的堿基種類(lèi)A、T、C、G產(chǎn)生的電流值變化，便可實(shí)現排序。由于DNA分子的毫秒級通過(guò)納米孔，基實(shí)現就可能達到高速排序。迄今已在聚腺嘌呤與聚胞嘧啶之間發(fā)現了電流值變化的差異。但為了排序，還需要靈敏度更高的檢測器等，尚有許多必須改進(jìn)之處。

走向高度集成系統

　　所介紹的電泳芯片已開(kāi)始有設備出售了，微芯片技術(shù)為了更大提高處理能力，正在發(fā)展成為把從細胞的DNA提取、PCR(聚合酶連鎖反應)等反應、電泳、雜混、激光誘發(fā)螢光檢測、電化學(xué)檢測、熱透鏡顯微鏡檢測等染色體分析所必需的所有基本處理，集成到幾平方厘米的微芯片上的集成型微芯片。

　　而且，隨著(zhù)集成化技術(shù)的急速進(jìn)步，細微加工將從微米領(lǐng)域轉向納米領(lǐng)域。代替過(guò)去用作DNA分離媒體的凝膠和聚合物，而把采用納米細微加工技術(shù)作成的納米柱配置在微通道中，實(shí)現不同凝膠或聚合物的DNA及蛋白質(zhì)的分離，開(kāi)發(fā)出微芯片上具有各種納米結構的器件，并實(shí)現極微量或單分子DNA或蛋白質(zhì)提取、放大、排序、多項檢測等集成化超高速分析技術(shù)。這樣的納米芯片技術(shù)也在進(jìn)行研究。

　　DNA分析中各種處理迄今都進(jìn)行了高速化的研究，但通過(guò)如圖6所示把所有處理微化、集成在同一芯片上，由于能激劇縮短各處理花費的時(shí)間，便可望使整個(gè)過(guò)程大大高速化，這才將真正進(jìn)化到“片上實(shí)驗室”。(蔡)