LWT | 浙江大學(xué)王岳飛團隊最新研究揭示伏磚茶風(fēng)味動(dòng)態(tài)變化過(guò)程

茯磚茶是一種具有豐富歷史遺產(chǎn)的重要類(lèi)型的黑茶，由于其獨特的風(fēng)味特征和眾多的健康益處，最近引起了人們的重新關(guān)注。真菌發(fā)酵是茯磚茶生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，在塑造其獨特品質(zhì)方面起著(zhù)至關(guān)重要的作用。在這個(gè)復雜的過(guò)程中，當接種真菌和各種內生菌在特定的高濕和適宜的溫度條件下茁壯成長(cháng)時(shí)，競爭和共生生命代謝活動(dòng)發(fā)生了動(dòng)態(tài)的相互作用。這種復雜的代謝干預導致茯磚茶原始成分發(fā)生深刻的生化變化，賦予茶一種精致而醇厚的香氣。目前對茯磚茶的研究主要集中在優(yōu)勢微生物、香氣以及微生物群對基本代謝物的影響上。然而，盡管有這些研究，在真菌發(fā)酵過(guò)程中，真菌與揮發(fā)性代謝物動(dòng)態(tài)進(jìn)化的關(guān)系、香氣轉化的分子基礎以及真菌合成香氣的具體途徑的研究仍然有限。

2024年6月4日，LWT-Food Science and Technology在線(xiàn)發(fā)表了浙江大學(xué)題為“Dynamical changes of volatile metabolites and identification of core fungi associated with aroma formation in Fu Brick tea during the fungal fermentation”的相關(guān)研究，研究利用ITS、揮發(fā)性代謝組以及電子鼻、電子舌等技術(shù)手段，旨在揭示伏磚茶在真菌發(fā)酵過(guò)程中真菌與揮發(fā)性物質(zhì)變化的相關(guān)關(guān)系。邁維代謝為本研究提供了GC-MS揮發(fā)性代謝組學(xué)的檢測和分析服務(wù)。

研究結果

1.電子鼻和電子舌分析：不同發(fā)酵時(shí)間具有不同的特征

首先利用電子鼻和電子舌捕捉茯磚茶的綜合香氣和風(fēng)味特征。根據采集的數據生成圖1所示的主坐標分析(PCoA)。電子鼻結果表明，D0到D6和D9到FT（成品伏磚茶）的樣本之間存在明顯的分離，在不同真菌發(fā)酵時(shí)間之間無(wú)顯著(zhù)交集。這強調了電子鼻分析在區分茯磚茶真菌發(fā)酵不同階段的香氣特征方面的功效。電子舌的PCoA結果進(jìn)一步表明樣品從D0和D3分離到D6。從雷達圖上可以看出，隨著(zhù)發(fā)酵時(shí)間的延長(cháng)，酸味傳感器的響應逐漸減弱，甜度傳感器的響應逐漸增強。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間電子鼻和電子舌分析

2.ITS數據分析

不同真菌發(fā)酵階段的有效真菌序列總數如圖2A所示，與FT相比，D0的數量略低。根據序列片段的相似性進(jìn)一步分類(lèi)，將7類(lèi)茯磚茶樣品中的真菌序列以97%的相似性水平進(jìn)行大量過(guò)濾和聚類(lèi)，得到234個(gè)OTU(圖2B)。值得注意的是，在所有7類(lèi)樣品的整個(gè)真菌發(fā)酵過(guò)程中，12個(gè)OTUs始終存在。隨著(zhù)真菌發(fā)酵時(shí)間的增加，OTU數量逐漸減少。有趣的是，在FT（成品伏磚茶）階段出現了四個(gè)額外的OTU，這種現象可能與干燥或儲存過(guò)程有關(guān)。

圖2 ITS數據分析

利用Chao1指數和Shannon指數進(jìn)一步估算了茯磚茶真菌的α多樣性。隨著(zhù)真菌發(fā)酵時(shí)間的增加，真菌種類(lèi)豐富度顯著(zhù)下降。具體而言，在D3處真菌物種豐富度略有增加。FT的真菌種類(lèi)豐富度高于D15。隨著(zhù)真菌發(fā)酵的進(jìn)行，Shannon指數逐漸降低，意味著(zhù)某些真菌獲得競爭優(yōu)勢，逐漸主導生態(tài)系統。在D9 ~ D15期間，Shannon指數略有上升，這可能是由于出現了第二優(yōu)勢真菌。結合Chao1指數，FT記錄的Shannon指數最低，說(shuō)明FT雖然真菌種類(lèi)增加，但有一個(gè)特殊的優(yōu)勢種占優(yōu)勢。

圖3 真菌α多樣性分析

為了全面評估β多樣性并直觀(guān)地描述樣本距離關(guān)系，采用了Hcluster方法進(jìn)行可視化，分析發(fā)現了茯磚茶真菌發(fā)酵過(guò)程中的兩個(gè)不同階段:第1階段在D0，第2階段從D3到FT。經(jīng)過(guò)差異篩選，值得注意的是，所有樣品的初級門(mén)均為p_子囊菌門(mén)，占有效序列的57.11% ~ 99.90%。D0階段，p_擔子菌門(mén)成為次生優(yōu)勢門(mén)，占有效序列的32.41%。但從D3開(kāi)始，這一比例有所下降，最終達到1.52%。在屬水平分析中，在D0期間鑒定出g_Wallemia、g_Penicillium和其他一些真菌，以耐鹽種為主。隨著(zhù)真菌發(fā)酵的推進(jìn)，它們的貢獻逐漸減少。隸屬于p_子囊菌門(mén)的Eurotium從D3到FT占據優(yōu)勢，占有效序列的82.00% ~ 99.05%。在D6結束時(shí)，曲霉與Eurotium的競爭停止，Eurotium在D9成為明顯的勝利者(g_曲霉屬真菌在D15期間略有增加，但在FT時(shí)再次下降)。關(guān)于在D9中出現亞優(yōu)勢菌株的猜測，物種注釋表明這種情況并未發(fā)生，Eurotium仍保持絕對優(yōu)勢。剩余的菌株，雖然在D9中略有恢復，但在D12中逐漸減少到可以忽略不計的水平。

進(jìn)一步對真菌進(jìn)行了相關(guān)網(wǎng)絡(luò )分析，以辨別它們在真菌發(fā)酵過(guò)程中的促進(jìn)、拮抗和/或競爭作用。其中，g_曲霉屬真菌和g_Eurotium的相對豐度最高，呈顯著(zhù)負相關(guān)?？紤]到g_Eurotium在茯磚茶中的優(yōu)勢地位，它與其他9個(gè)真菌屬始終保持負相關(guān)。此外，在與木質(zhì)素降解、土壤微生物、木材內生菌和與樹(shù)木的共生關(guān)系等不同功能相關(guān)的幾個(gè)屬之間觀(guān)察到值得注意的正相關(guān)，這些都與真菌發(fā)酵有關(guān)。

圖4 β多樣性分析

3.揮發(fā)性代謝組檢測和分析

揮發(fā)性物質(zhì)的含量對茶葉香氣的影響至關(guān)重要。利用揮發(fā)性代謝組共鑒定到包括51種酯類(lèi)、50種雜環(huán)化合物、48種萜類(lèi)、30種醛類(lèi)、22種芳烴和其他化合物（圖5B）。PCA分析表明在階段I (D0到D6)和階段II (D9到FT)之間觀(guān)察到明顯的分離（圖5A），與早期的電子鼻結果一致。其中105個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)在茯磚茶真菌發(fā)酵過(guò)程中直接產(chǎn)生風(fēng)味(rOAV>1)(圖5C)。揮發(fā)性物質(zhì)的數量先增加后減少，從萜類(lèi)化合物轉向雜環(huán)和硫化合物。值得注意的是1-p-menthene-8-thiol（KMW0466）一直主導著(zhù)風(fēng)味譜。

在第1階段，風(fēng)味貢獻前5位分別是1-p-menthene-8-thiol（KMW0466）、β-離子酮（WMW0051*150）、5-乙  基-3-羥基-4-甲基-2 (5H)-呋喃酮（KMW0383）、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪（KMW0286）和反式-β-離子酮（KMW0583*150）。在第二階段，前11名的貢獻保持一致，KMW0466、KMW0286、WMW0051*150、KMW0383和D94(苯甲硫醇)構成了主要的5種風(fēng)味物質(zhì)。不同的vm具有不同的香氣特征，表明從D9開(kāi)始從甜美的花香和水果香味過(guò)渡到更復雜的堅果和黃瓜香味。

圖5 揮發(fā)性物質(zhì)檢測和分析

采用嚴格的篩選條件(VIP>1.0,p < 0.05)對一期和二期揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行比較分析。結果顯示，22個(gè)DVMs上調(圖6A)，13個(gè)DVMs下調(圖6B)。值得注意的是，上調的化合物主要是醛類(lèi)、酮類(lèi)和萜類(lèi)，而下調的化合物主要是萜類(lèi)。這些轉變促進(jìn)了茯磚茶的轉型香氣從木質(zhì)、蠟質(zhì)和玫瑰色到更明顯的綠色、黃瓜味和脂肪味(圖6C)。此外，茯磚茶中的某些酮類(lèi)和醛類(lèi)，超過(guò)了其他黑茶中的酮類(lèi)和醛類(lèi)，顯著(zhù)影響了其獨特的風(fēng)味。值得注意的是，KMW0421(水楊酸甲酯)和KMW0379(2-戊基吡啶)是變化最大的DVM，是茯磚茶獨特風(fēng)味的關(guān)鍵貢獻者。

圖6 風(fēng)味組學(xué)分析

4.ITS與揮發(fā)性代謝組聯(lián)合分析

利用Spearman相關(guān)分析，構建了茯磚茶前6個(gè)真菌屬與DVMs的結合網(wǎng)絡(luò )。結果表明g_Canadida與任何上調的DVMs之間沒(méi)有相關(guān)性。相反，除(E, E)-3,5- octadien -2-one（XMW0186.139 ）外，其他上調的DVMs與g_Eurotium呈正相關(guān)，與g_Aspergillus呈負相關(guān)。同樣，所有下調的DVMs與g_Eurotium呈負相關(guān)，與g_Wallemia呈正相關(guān)。除1-Nonanol（KMW0344 ）外，g_Aspergillus與其他下調產(chǎn)物呈正相關(guān)。此外，DVMs與g_Canadida和g_Penicillium的相關(guān)性也與g_Wallemia的相關(guān)性相似。綜上所述，這三個(gè)屬的相對豐度呈正相關(guān)，進(jìn)一步確定g_Penicillium的相對豐度與g_Aspergillus呈正相關(guān)（圖7）。

圖7 真菌與揮發(fā)性代謝物相關(guān)性分析

考慮到微生物活動(dòng)，尤其是外源酶的分泌對黑茶中芳香物質(zhì)轉化的重大影響，進(jìn)一步用picrust2數據庫對真菌進(jìn)行注釋?zhuān)酝茢嗝傅墓δ埽▓D8）。該預測分析確定了9種酶——腺苷-三磷酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖糖苷酶、羧酯酶、過(guò)氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、外顯α-唾液酸酶和蛋白酪氨酸-磷酸酶——在整個(gè)真菌發(fā)酵過(guò)程中積極參與?？紤]到D9后伏磚茶固化后的香氣變化，推測香氣產(chǎn)生的主要驅動(dòng)因素與外顯α-唾液酸酶活性密切相關(guān)。

圖8 典型酶活性分析

為了揭示DVMs發(fā)生的潛在差異，對茯磚茶在真菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了KEGG功能注釋?zhuān)哺患?條和9條途徑。在前者的路徑包含在后者中。分類(lèi)結果顯示，真菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要通過(guò)多種途徑進(jìn)行合成，包括氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、萜類(lèi)和聚酮代謝、外源降解和代謝。進(jìn)一步研究各階段顯著(zhù)上調和下調的物質(zhì)(D0、D3、D6、D9、D12、D15、FT)，確定苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、萜類(lèi)骨架生物合成和α-亞麻酸代謝是關(guān)鍵物質(zhì)形成的重要途徑(圖9)。值得注意的是，如上所述，真菌和揮發(fā)性物質(zhì)的進(jìn)化在D9后趨于穩定，D12后物質(zhì)沒(méi)有發(fā)生顯著(zhù)變化。因此，該圖可以作為KEGG通路直至D12的總結。

圖9 伏磚茶風(fēng)味形成過(guò)程中的重要通路

研究總結

本研究對伏磚茶真菌發(fā)酵過(guò)程中獲得的7組工藝樣品進(jìn)行了系統的比較研究。除了利用電子感覺(jué)系統對伏磚茶進(jìn)行基本評估外，研究還深入研究了真菌群落演替和揮發(fā)性物質(zhì)在這一復雜過(guò)程中的變化動(dòng)態(tài)。ITS結果表明，g_Eurotium在D3后成為優(yōu)勢菌。同時(shí)，GC-MS結果揭示了真菌發(fā)酵過(guò)程中伏磚茶揮發(fā)性譜的實(shí)質(zhì)性變化，近35%的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)歷了顯著(zhù)的變化。在rOAV>1的105個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)中，對伏磚茶的關(guān)鍵香氣貢獻因子包括1-對甲烷-8-硫醇、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪、β-紫羅蘭酮和5-乙 基-3-羥基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮。這些化合物在整個(gè)真菌發(fā)酵過(guò)程中始終占大多數，有助于注入綠色，甜味，花香和水果香氣。