一種新型ATP食品衛生檢測儀的研制

1、引言

食品安全是一個(gè)直接關(guān)系到人民群眾生命健康和社會(huì )穩定的重大公共安全問(wèn)題，而細菌性污染又是其中極為重要的因素。如何能夠快速、有效的檢測食品中細菌的含量，是當今食品安全必然涉及的技術(shù)課題。目前檢測細菌含量的主要方法如下：

（1）傳統培養檢測方法：傳統培養法檢測被稱(chēng)為“金標方法”，但其培養時(shí)間長(cháng)且對檢測條件以及檢測人員的專(zhuān)業(yè)水平要求較高。

（2）ATP(三磷酸腺苷)生物化學(xué)發(fā)光法：利用細胞的特征來(lái)測定細菌數，是快速檢測菌落總數的一個(gè)發(fā)展方向。這種方法可以在幾分鐘內得出結果，大大縮短了檢測時(shí)間。

（3）其他檢測方法：除了上述兩種檢測方法外，還有許多檢測方法正在迅速發(fā)展。其中包括免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法以及其他生物化學(xué)方法[1]。這些檢測方法各有千秋，但許多檢測方法或因設備試劑比較昂貴、或因操作過(guò)程復雜、或因實(shí)驗條件較為嚴格，不適用于食品衛生狀況的現場(chǎng)檢測。

可見(jiàn)ATP生物化學(xué)發(fā)光法具有極大的優(yōu)點(diǎn)。但是目前大部分ATP衛生檢測儀采用了光電倍增管（PMT）作為熒光探測器[2-3]，閃光型熒光素酶作為檢測試劑，導致體積較大，價(jià)格昂貴，僅適合實(shí)驗室的驗證工作，極大的限制了其在食品生產(chǎn)衛生檢測過(guò)程中的應用。為了克服其缺點(diǎn)，本文采用新型硅光電二極管作為熒光探測器，輝光型熒光素酶作為檢測試劑，設計出一種新型的ATP食品衛生檢測儀，具有便攜性、功耗低、高靈敏度和速度快的優(yōu)點(diǎn)。

2、ATP生物化學(xué)發(fā)光檢測方案

2.1 ATP生物化學(xué)發(fā)光檢測原理

ATP是包括微生物在內的一切活生物細胞能量的來(lái)源。它在蟲(chóng)熒光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及二價(jià)鎂離子的作用下釋放出熒光，其反應式為[4]：

強度呈線(xiàn)性關(guān)系，用光度計測出發(fā)光強度，也就得到了細菌總數[5]。這種方法可以在幾分鐘內得到結果，大大縮短了檢測時(shí)間。

2.2 ATP生物發(fā)光酶的選擇

當前商業(yè)化的ATP螢火蟲(chóng)熒光素-蟲(chóng)熒光素酶主要分為閃光型和輝光型兩種：

（1）閃光型（Flash） 光在幾秒鐘內就能發(fā)射完。發(fā)光過(guò)程中光強很快到達峰值然后迅速下降（1-3s）[2]。

（2）輝光型（Glow） 有些商業(yè)化的熒光素酶檢測系統采用特殊的方法，使得酶的活性高，產(chǎn)生的光強度強，在測試的幾分鐘之內可以保持穩定。

由于閃光型發(fā)光持續時(shí)間短，對此類(lèi)型光進(jìn)行測試必須要采用自動(dòng)加樣系統，這使得檢測儀的體積增大，攜帶不方便，不利于對食品生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行實(shí)時(shí)現場(chǎng)檢測。本文采用輝光型酶作為檢測試劑，只要在兩分鐘之內對試樣檢測即可，不需要自動(dòng)加樣系統克服了閃光型酶的缺點(diǎn)。

3、系統設計

3.1 硬件設計

儀器的硬件部分主要由取樣測試室、電源模塊、微弱熒光檢測模塊、校準模塊、單片機控制模塊、通信模塊和人機對話(huà)模塊等部分組成。儀器硬件結構如圖1所示。

此測試儀在設計過(guò)程中面臨的兩個(gè)突出的難點(diǎn)在于儀器近乎苛刻的超低功耗要求和對超微弱熒光的檢測。針對這兩點(diǎn)，本文對電源模塊和微弱熒光檢測模塊采取如下設計方案。

（1）電源模塊 由于儀器的便攜特性，采用兩節普通的1.5V堿性電池作為儀器的電源。利用具有電池反接保護功能的升壓開(kāi)關(guān)電源芯片MAX1833，將電池電壓轉化整個(gè)硬件系統的3.3V工作電壓，和最大150mA的電流輸出。此芯片靜態(tài)電流為4μA，關(guān)斷電流小于1μA，電源轉換效率高達90%。

微弱熒光檢測模塊需要精度和穩定性要求更高的電源供電，本文選用美國國家半導體公司生產(chǎn)的低壓差線(xiàn)形穩壓芯片LP2982，可提供精準的3V電壓和最大50mA的電流輸出，具有輸出電壓精度1%，低噪聲和關(guān)斷電流小于1μA等特點(diǎn)。電源模塊電路如圖2所示。

以上供電模塊的設計，具有電源轉換效率高，靜態(tài)漏電流低等優(yōu)點(diǎn)。計算證明這樣的設計可使儀器待機長(cháng)達6個(gè)月。

（2）微弱熒光檢測模塊 傳統ATP檢測儀采用PMT作為光電傳感器，對試樣所發(fā)出的熒光強度進(jìn)行檢測。由于PMT工作時(shí)需要正負高壓電源供電，使得用其作為光電探測器的衛生檢測儀體積較大且價(jià)格昂貴，不方便攜帶，極大的限制了此種檢測儀的應用。本文采用日本濱松生產(chǎn)的s1227系列硅光電二極管作為光電傳感器，具有體積較小，靈敏度高，暗電流小等優(yōu)點(diǎn)。與PMT相比，硅光電二極管本身沒(méi)有電流的放大作用，因此需要設計良好的放大電路將光電二極管輸出的微弱電流進(jìn)行放大。本文采取以下兩種措施，很好的解決了微弱電流信號的放大問(wèn)題：

① 選用高性能的集成運算放大器 本文采用ADI公司生產(chǎn)的AD8605運算放大器芯片作為放大器。此放大器具有偏置電壓低，輸入電流低（pA級），電壓電流噪聲低等優(yōu)點(diǎn)，是光電二極管放大電路的最佳選擇。光電二極管采用光伏模式，可以非常精確的線(xiàn)性工作，無(wú)暗電流，整個(gè)電路的噪聲低。

② 對整個(gè)微弱熒光檢測模塊進(jìn)行屏蔽 本文采用的特殊設計的鋁殼進(jìn)行屏蔽的方法取得了很好的效果。信號放大后，由具有16位Δ-ΣA/D轉換器的MAX1407數據采集芯片進(jìn)行采樣。整個(gè)信號調理電路如圖3所示。

此外，放大器的增益漂移也是一個(gè)必須考慮的問(wèn)題。本文設計了校準模塊來(lái)解決此問(wèn)題：

光電二極管內阻和反饋電阻R的溫度特性會(huì )導致整個(gè)電路的放大倍數隨著(zhù)溫度而變化。本文采用綠光LED（發(fā)射出560nm左右的光，與ATP生物化學(xué)發(fā)光光譜非常匹配）作為校準光源來(lái)解決此問(wèn)題。LED發(fā)光具有穩定的低漂移，在一定范圍內發(fā)光強度與電流成正比。設電流為I1，I2為通過(guò)LED的電流，放大電路輸出電壓分別為V1，V2，利用公式（1）：

可以計算出當前環(huán)境下的放大系數β，與標準放大倍數相乘就可以得到當前放大倍數。此校準模塊，具有自動(dòng)校準的特點(diǎn)，不需要人工干預。

采用6鍵簿膜開(kāi)關(guān)作為儀器的輸入部分，輸出部分為字符型LCD。具有打印接口以及與上位機進(jìn)行通信的RS232接口。按鍵少，界面友好，操作簡(jiǎn)單。

3.2 軟件設計

由于整個(gè)系統功能比較復雜，為了充分利用系統的硬件資源，方便對程序的管理以及升級，儀器采用μC/OS-II嵌入式操作系統管理整個(gè)軟件系統。整個(gè)軟件系統采用三層結構，由內向外分別是操作系統層、應用層、硬件層，如圖4所示。

應用層是依據系統的基本功能以及對硬件的依賴(lài)來(lái)劃分的。主要有以下五個(gè)任務(wù)：信號采集處理任務(wù)、命令處理任務(wù)、顯示任務(wù)、數據存儲任務(wù)和通信任務(wù)。根據自身的性質(zhì)和對實(shí)時(shí)性要求的不同，應對這五項任務(wù)分配不同的優(yōu)先級。

（1）信號采集處理任務(wù) 控制MAX1407對試樣的發(fā)光值進(jìn)行采樣并對獲得的數據進(jìn)行處理。是整個(gè)系統的核心，在本系統中具有最高優(yōu)先級。平時(shí)處于掛起狀態(tài)，由命令處理任務(wù)激活,數據采集完成后，激活數據存儲任務(wù)，然后掛起。

（2）命令處理任務(wù) 根據鍵值和系統當前所處狀態(tài)激活其他任務(wù)，任務(wù)優(yōu)先級較高，在本系統中處于第二優(yōu)先級。

（3）顯示任務(wù) 在LCD上實(shí)時(shí)顯示各種數據及狀態(tài)，任務(wù)優(yōu)先級較高，為第三優(yōu)先級。

（4）數據存儲任務(wù) 通過(guò)SPI總線(xiàn)與25AA640芯片進(jìn)行通信，存儲檢測數據。

（5）通信任務(wù) 與上位機通信，傳送檢測數據或接收上位機命令。

系統運行時(shí)，首先進(jìn)行系統初始化操作，即初始化所有數據結構，分配堆?？臻g，然后建立任務(wù)間通信的信號量或者消息郵箱，進(jìn)而創(chuàng )建任務(wù)，所有任務(wù)被置于就緒態(tài)。多任務(wù)環(huán)境開(kāi)始運行，命令處理任務(wù)根據鍵盤(pán)狀態(tài)激活其他任務(wù)，從而實(shí)現系統的各個(gè)功能。

4、測量結果與分析

常見(jiàn)的微生物如真菌類(lèi)，其ATP含量的數量級為10-11mol/細胞，細菌類(lèi)為10-18mol/細胞[5]。根據食品生產(chǎn)過(guò)程中對環(huán)境衛生的要求，本儀器的設計目標是能夠準確檢測10-15-10-11mol的ATP。當ATP的量在此范圍時(shí)，儀器應該具有良好的重復性和線(xiàn)性。

為了測試儀器的性能，采用美國普洛麥格公司生產(chǎn)的輝光型熒光素-熒光素酶作為檢測試劑，將配置的不同量的ATP標準液（10-16-10-7mol）加入到螢火蟲(chóng)-熒光素酶中，用儀器進(jìn)行測量。為了避免偶然性，對不同數量級的ATP量進(jìn)行多次試驗。將測到的數據進(jìn)行處理，繪制不同物質(zhì)的量的ATP與發(fā)光值的對應曲線(xiàn)如圖5所示：

可以看出，發(fā)光曲線(xiàn)明顯的分為三個(gè)部分，下面分別對這三個(gè)部分進(jìn)行分析：

（1）區域A 此部分發(fā)光量隨ATP量的增加而稍微增加但不成線(xiàn)性關(guān)系。這是因為儀器和酶存在背景噪聲，當ATP的量很小時(shí)，發(fā)出的光十分微弱，被背景噪聲淹沒(méi)。

（2）區域B 在此區域內發(fā)光量與ATP的量成7個(gè)數量級的線(xiàn)性關(guān)系。因此，可以用發(fā)光值作為評判ATP量的方法之一。

（3）區域C 在此區域內的ATP量大，而參與反應的酶的含量一定，造成ATP剩余，發(fā)光量漸趨飽和。

由測量曲線(xiàn)可以得出，本文所設計的ATP食品衛生檢測儀在檢測10-15-10-11mol量的ATP時(shí)，具有良好的線(xiàn)性和可重復性，達到了設計要求。因此，本檢測儀可以實(shí)現對細菌含量的現場(chǎng)快速檢測。

5、結論

本儀器采用ATP生物化學(xué)發(fā)光法與嵌入式系統相結合的方法，使得對微生物含量的檢測時(shí)間大大縮短，只需要兩分鐘即可得到測試結果。特別由于采用硅光電二極管作為光電傳感器，解決了通常使用PMT光電倍增管體積大，價(jià)格昂貴，不方便攜帶的缺點(diǎn)。測試儀的體積小，方便攜帶，功耗低，待機時(shí)間長(cháng)，檢測精度高，能夠方便的對試樣進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，在食品生產(chǎn)衛生檢測領(lǐng)域具有很好的應用前景。