如何確定光譜信號就是所標記探針的信號

　　1.自發(fā)熒光的可變性。a在不同激發(fā)光條件下，自發(fā)熒光會(huì )有明顯不同；b動(dòng)物身體的不同部位會(huì )有不同的自發(fā)熒光；c同一只動(dòng)物在不同時(shí)間自發(fā)熒光的波譜和強度也可以不同；d不同小鼠的自發(fā)熒光在波譜和強度上也有差別；e有時(shí)會(huì )受到飼料的影響。

　　2.所用探針的發(fā)射波長(cháng)較長(cháng)。用于基因和細胞水平熒光探針或熒光蛋白發(fā)射波長(cháng)通常在600nm以下，而活體研究最佳的發(fā)射波長(cháng)范圍在600-900nm之間。

　　3.受探針濃度的影響。熒光探針通常通過(guò)尾靜脈打入體內，探針會(huì )被動(dòng)物的血液和組織稀釋?zhuān)绻麤](méi)有明顯的靶向，在活體內信號會(huì )比較弱，因此探針的靶向性一定要明確，如果沒(méi)有靶向性，在活體條件下尋找探針的特征光譜會(huì )非常難。

　　4.受位置的影響。如果探針靶向的部位距體表較遠，一方面激發(fā)光的射入會(huì )減少，同時(shí)發(fā)射光也會(huì )被組織吸收，位置越深，減少越多。因此如果靶向的部位較深，一定要保證探針的濃度使發(fā)光足夠強，同時(shí)盡量選用發(fā)射波長(cháng)較長(cháng)的探針。

　　5.合成的探針在活體條件下容易發(fā)生變化。用化學(xué)或生物的方法合成探針通常在較純的溶劑中發(fā)生反應，但是活體條件下，動(dòng)物的血液、組織液成分復雜，親水或疏水性質(zhì)難以預測，網(wǎng)狀內皮系統大量存在，在體外表現很好的探針也有可能在體內發(fā)生復雜的變化，導致探針發(fā)生結構改變或脫落，從而發(fā)射波譜也會(huì )發(fā)生未知的改變。

　　活體熒光成像面臨著(zhù)多方面的挑戰，如何才能做到準確無(wú)誤的尋找到所要的波譜，進(jìn)而進(jìn)行合適的光譜分離呢？以下是一些做體內熒光成像的一些建議：

　　1.探針體外表現穩定可靠。探針合成之后必須要在打入體內之前進(jìn)行成像，確定發(fā)射波譜和強度，需要考察不同批次探針之間是否存在差異，是否有淬滅現象，如果可能的話(huà)，用血液等生物體液溶解探針觀(guān)察是否存在變化。另外在體外觀(guān)察探針時(shí)，也一定要用溶劑做對照。

　　2.要確定靶向性。也就是說(shuō)要有陽(yáng)性對照，比如說(shuō)要做腫瘤的早期診斷，盡量參考前人研究先用確定能夠靶向的分子作為陽(yáng)性對照，這樣打入體內后，確定能夠在腫瘤位置找到探針的波譜，如此確定之后，找到適合體內光譜分離的拆分條件，用于之后的進(jìn)一步實(shí)驗。

　　3.活體成像時(shí)一定要有對照。也就是說(shuō)有陰性對照組，比如通過(guò)陽(yáng)性對照組確定波譜之后，以此光譜分離的拆分條件對陰性對照組進(jìn)行拆分，如果條件合適的話(huà)，陰性對照組應該是沒(méi)有相應信號的。如此，再比較拆分條件中探針的發(fā)射波長(cháng)和體外觀(guān)察時(shí)的發(fā)射波長(cháng)，如果兩者比較接近，那么就能夠肯定所尋找的探針波譜就是所考察的信號。

　　4.通過(guò)已有知識和時(shí)間變化來(lái)確定。如果已知所考察探針是親肝的或親腎的，在活體內在肝或腎的部位出現信號的聚集，那么此處的信號可能會(huì )是所考察探針的信號，另外根據信號隨時(shí)間的變化來(lái)確定是不是所要的信號，比如腫瘤部位的某種信號在注射探針后有明顯的隨時(shí)間的上升后下降的過(guò)程，這種現象也提示這個(gè)信號就是所考察探針的信號。

　　5.實(shí)驗初期，盡量選用較高濃度或發(fā)光強度的探針。新合成的探針一般會(huì )首先觀(guān)察它的靶向性和體內代謝情況，這時(shí)盡量選用最大的劑量或濃度，在動(dòng)物生命體征不受影響的情況下，越多含量的探針對于體內觀(guān)察越有利。在對考察探針體內靶向及代謝情況比較了解之后再考慮減少含量，達到最優(yōu)的生物學(xué)效果。

　　通過(guò)以上建議，可以歸納為如下流程圖：