非成像式流式細胞儀的發(fā)展與應用

　　流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，FCM）也稱(chēng)為熒光激活細胞分類(lèi)術(shù)（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS） ，是利用流式細胞儀對處在快速、直線(xiàn)、流動(dòng)狀態(tài)中的單細胞或者生物顆粒進(jìn)行多參數、快速定量分析，同時(shí)對特定群體加以分選的現代細胞分析技術(shù)。流式細胞儀（Flow Cytometer）是集激光技術(shù)、光電檢測技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)以及計算機技術(shù)于一體的新型高科技儀器。它能夠高效檢測細胞大小、粒度、表面積等細胞結構參數和細胞表面 / 胞質(zhì) / 核的特異性抗原、細胞內細胞因子、酶活性、Ca2+、細胞活性等細胞功能參數， 同時(shí)還具有細胞分選和計數能力。自上世紀70年代第一臺流式細胞儀問(wèn)世以來(lái)，歷經(jīng) 40 多年的迅猛發(fā)展，目前流式細胞儀已經(jīng)廣泛應用于生物學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)以及細胞凋亡檢測和臨床檢驗等領(lǐng)域。

　　1? 流式細胞儀的結構

　　流式細胞儀主要由液流系統、光學(xué)系統、電子系統和細胞分選系統 4 部分組成。經(jīng)過(guò)特定熒光染色的待測樣本細胞懸液，在鞘流的包圍約束下，細胞成單列排布，由流動(dòng)室噴嘴高速?lài)姵?，形成細胞液柱。液柱與激光束垂直相交，相交位置即為檢測區，在入射激光照射下產(chǎn)生熒光信號和前向散射光信號（FSC，Forward Scatter）與90°側向散射光信號（SSC，Side Scatter） ，可被電子系統檢測并輸入到計算機利用專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行細胞多參數分析與分選。

　　1.1? 液流系統

　　液流系統主要負責將待測樣品從樣品室運送到流動(dòng)室的測量區域，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心，并且在一次曝光時(shí)間內，只允許一個(gè)細胞通過(guò)激光束，然后根據需要，液流流入廢液桶或者分選收集管。液流系統主要由流動(dòng)室和液流驅動(dòng)系統構成。流動(dòng)室內充滿(mǎn)鞘液，根據層流原理，在鞘液的包圍下，細胞排成單列從流動(dòng)室的噴嘴流出，并且被鞘液包圍形成細胞液柱。另外，同軸流動(dòng)的設計，使得樣品流（核流）和鞘流始終保持分層鞘流的狀態(tài)。

　　1.2? 光學(xué)系統

　　光學(xué)系統負責產(chǎn)生并采集熒光、散射光信號，主要由包括激光、光纖、光束形成棱鏡、聚焦鏡的光學(xué)激發(fā)系統和包括熒光物鏡、光纖、光學(xué)濾片、檢測器的光學(xué)采集系統組成。目前流式細胞儀廣泛使用的是 488nm 的氬離子激光器和 635nm 的氦 - 氖激光器。光學(xué)濾光片放置在光電倍增管前面，對去除干擾信號、提高結果的準確性至關(guān)重要。

　　1.3? 電子系統

　　電子系統的功能是將熒光和散射光信號轉換成電信號， 并進(jìn)行數字化處理后送入計算機用專(zhuān)用軟件進(jìn)行分析，包括光電轉化器、信號放大器、信號處理系統和計算機軟件分析系統。液柱中的細胞經(jīng)過(guò)測量區域被激光照射，產(chǎn)生熒光信號和前向角散射與 90°側向角散射信號。其中熒光信號由光電倍增管檢測，2 個(gè)散射光信號由光電二極管檢測。熒光信號與產(chǎn)生熒光的化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，前向散射光信號與細胞大小有關(guān)，90°側向散射光信號與細胞粒度有關(guān)。通過(guò)安裝多個(gè)濾光片和不同波長(cháng)的激光器就能得到更多的熒光信號和散射光信號，這對于人們認識細胞內化學(xué)物質(zhì)的相互作用具有十分重要的現實(shí)意義。

　　1.4? 分選系統

　　利用流動(dòng)室噴嘴上的高頻壓電晶體的振動(dòng)，將液流變成只包含單個(gè)靶細胞的小液滴，系統根據鞘流的流速與晶體振動(dòng)的頻率，精確算出小液滴的間距，然后對其施加相應的電壓，當小液滴通過(guò)正負極板時(shí)就會(huì )發(fā)生偏轉，流入相應的收集管里， 不帶電的液滴就會(huì )流入中間的廢液桶里，從而實(shí)現對細胞（ 包括中性粒細胞 ） 的分選 　　。

　　2? 流式細胞儀的最新進(jìn)展

　　2.1? 光學(xué)系統的完善

　　隨著(zhù)激光技術(shù)的發(fā)展，激光器的性能更加優(yōu)異，價(jià)格也更加低廉，這使得激光逐漸取代非相干光源，在流式細胞儀中得以廣泛應用。目前，除德國的Partec 等公司的部分產(chǎn)品仍使用汞燈作為光源激發(fā)紫外的熒光物質(zhì)外，多數的流式細胞儀都配備多個(gè)激光器，同時(shí)發(fā)出不同波長(cháng)的激光以激發(fā)出多種熒光。例如BD 公司的 FACSAria 流式細胞分選儀除配備較為常用的488nm藍光和640nm紅光外，還配備 407nm 光源。同時(shí)，染料激光器的出現，使得光源發(fā)出連續可調的光譜成為可能，極大地擴展波長(cháng)范圍，可以滿(mǎn)足用戶(hù)多種特殊的需求。另外，通過(guò)配備多個(gè)光學(xué)濾光片，可同時(shí)檢測多種熒光信號和包括 FSC 和 SSC 在內的信號，豐富人們的視野，更好地實(shí)現對細胞的檢測。

　　2.2? 靈敏度和分辨率的提高

　　靈敏度反映儀器能夠檢測到最弱的熒光和散射光信號，直接決定能否檢測出待檢測指標。靈敏度主要與待檢測物體被激光照射效率和熒光接收效率有關(guān)，靈敏度的高低也是衡量流式細胞儀性能的最重要指標之一 ［4］。通過(guò)使用更加貼近最大吸收波長(cháng)的激發(fā)光源和改善光路系統設計能夠有效提高流式細胞儀靈敏度，同時(shí)，使用較高靈敏度的光電檢測元件也可以分析微弱的熒光信號，較大程度上提高流式細胞儀靈敏度。目前流式細胞儀多使用石英微流動(dòng)室 和數值孔徑較大的物鏡，使得收集到的細胞熒光信號顯著(zhù)增強。另外，通過(guò)使用光子計數系統，也能夠實(shí)現對一些微弱熒光信號的檢測。光子計數系統具有較高靈敏度，但是檢測面積比較小，使用時(shí)應該用高質(zhì)量的透鏡組將光子匯聚到它的有效面積上。隨著(zhù)熒光技術(shù)的發(fā)展，市場(chǎng)上出現更多類(lèi)型的熒光染料可供選擇，熒光的激發(fā)光強也有很大的提高， 實(shí)現靈敏度提高。另外， 使用高透射率、高折射率的光纖，也能夠更好地與光源、光電檢測器和芯片耦合，顯著(zhù)降低光強損失，提高儀器靈敏度。