基于高內涵顯微成像流式細胞儀的免疫學(xué)研究

感染時(shí)初始CD8+T細胞被激活、增殖分化為效應CD8+T細胞，并伴隨體溫升高。要知道體溫升高是否會(huì )進(jìn)一步調控CD8+T細胞的激活分化，首先要解決對T細胞激活分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行定量分析。

Amnis公司ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀結合熒光顯微鏡和流式細胞儀的優(yōu)點(diǎn)，可在快速分析大量細胞的同時(shí)獲得每個(gè)細胞的圖像，進(jìn)行客觀(guān)定量的分析。我們知道，發(fā)燒的時(shí)候是機體正在對外來(lái)病原菌進(jìn)行抵抗。以往我們只是知道高溫能夠抑制病原菌的復制能力。但是來(lái)自于美國紐約的羅茲韋爾公園癌癥研究所(RPCI)的免疫與流式細胞儀研究組近日的研究表明，發(fā)燒還能夠提高免疫系統的功能，確切的說(shuō)，是CD8+T細胞的功能[Thomas A. Mace, JLB,2011]。

在這篇研究中，美國Amnis公司的ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀發(fā)揮了不可估量的作用，不僅完美的解決了傳統的流式分析和傳統圖像觀(guān)察的技術(shù)瓶頸，而且其強大的圖像定量分析能力也使之成為免疫學(xué)研究的利器。在炎癥或者受到病原菌侵染的時(shí)候，初始CD8+T細胞通過(guò)與APC細胞相互作用而被激活，進(jìn)而增值、分化為效應CD8+T細胞，此激活過(guò)程可能會(huì )伴隨著(zhù)體溫的升高。但是人們仍不了解體溫的升高是否又會(huì )進(jìn)一步調控CD8+T細胞的激活和分化。

要解決這一問(wèn)題，首先要解決的是如何對T細胞的激活和分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行定量分析。而美國Amnis公司推出的ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀使得這一問(wèn)題迎刃而解：該系統結合了熒光顯微鏡和流式細胞儀的優(yōu)點(diǎn)，能夠在快速分析大量的細胞的同時(shí)獲得每個(gè)細胞的圖像，并可以對這些圖像進(jìn)行客觀(guān)、定量的分析。

近日，美國紐約的羅茲韋爾公園癌癥研究所《白細胞生物學(xué)雜志》雜志上發(fā)表了他們的研究結果：研究者利用ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀對較低體溫(33°C和37°C)以及較高體溫(39.5°C)下小鼠CD8+T細胞與APC細胞的結合情況進(jìn)行了定量分析，結果表明，體溫升高后增強了二者的結合率。

另外更重要的是，研究者還發(fā)現實(shí)驗組小鼠CD8+T細胞數量顯著(zhù)增加，并且其膜表面的GM1以及CD8共受體聚集成簇從而影響了膜的流動(dòng)性。這些結果揭示了發(fā)燒引起的體溫增加能夠通過(guò)提高效應細胞群體的數量來(lái)影響抗原特異性CD8+T細胞所調節的應激效應。在該研究中，ImageStream顯示了其強大的圖像定量分析能力。

研究者首先從實(shí)驗小鼠體內分離了初始CD8+T細胞，然后分別在33°C、37°C以及39.5°C孵育6小時(shí)后，通過(guò)用ImageStream分析其細胞膜的流動(dòng)性。由于ImageStream能夠對檢測到細胞進(jìn)行成像，所以可以直觀(guān)的顯示出FITC標記的GM1蛋白均勻分布或成簇分布的情況(圖1B)。

通過(guò)軟件對整個(gè)群體細胞進(jìn)行定量的圖像分析，研究者利用ImageStream軟件中的BrightDetail Intensity參數對細胞進(jìn)行分析，發(fā)現溫度升高至39.5°C后細胞膜表面的GM1成簇現象明顯增加(圖1C)。另外，有報道表明T細胞激活時(shí)TCR信號復合體也會(huì )在細胞膜表面成簇。因此，研究者也對該復合體進(jìn)行了分析，同樣獲得了類(lèi)似的結果(圖1G和圖H)。

為了檢測溫度是否會(huì )影響CD8+T細胞與APC細胞二連體的形成，研究者將初始CD8+T細胞分別在37°或39.5°C 孵育6小時(shí)，然后和C57BL/6脾細胞共培養，實(shí)驗組用gp10025-33多肽處理。最后用ImageStream對發(fā)生免疫突觸的二連體細胞的數量進(jìn)行分析。

首先通過(guò)明場(chǎng)和Aspect Ratio(細胞的短軸/長(cháng)軸)設門(mén)區分單細胞和二連體細胞(圖2A和B，R1為單細胞，R2為二連體細胞)，然后通過(guò)CD8+Thy1.1+ (即 CD8+ T cells)和CD11b+ (即APC) 的表達進(jìn)行設門(mén)圈選出T細胞和APC的雙聯(lián)體細胞(圖2C)。實(shí)驗結果表明，溫度的升高使CD8+T細胞與APC二連體細胞的比例顯著(zhù)增加(圖2D)。

圖2.溫度的升高導致CD8+T細胞和APC細胞的二連體的比例增加

接下來(lái)，研究者希望探究CD8+T細胞的共受體是否也會(huì )隨著(zhù)溫度的增加而聚集成簇。該共受體分子也和TCRβ一樣，是對CD8+T細胞激活非常重要的分子。通過(guò)研究證實(shí)了作者的猜測(圖3A和3B)。

圖3.小鼠的升高導致CD8+T細胞膜表面共受體成簇比例增加

同時(shí)研究者還利用ImageStream軟件中的Similarity參數對CD8共受體與GM1在細胞膜共定位情況進(jìn)行了分析，但是結果表明小鼠體溫增加前后的similarity值沒(méi)有差異(數據未顯示)。為了進(jìn)一步研究GM1在T細胞中的成簇情況，研究者分析了GM1和陰性對照CD71的共定位情況，結果表明在小鼠體溫增加前后similarity的值有所下降(右圖C和D)。圖像顯示CD71分子在小鼠體溫升高后并沒(méi)有和GM1共成簇(cocluster)，如右圖E所示。

最后，研究者認為CD8+T細胞及其分化為效應細胞的過(guò)程是對溫度敏感的。如果CD8+T細胞先處于較高的溫度下，然后接受到抗原刺激時(shí)會(huì )更加快速和有效的作出響應。在此類(lèi)免疫學(xué)研究中，研究者遇到的最大的技術(shù)瓶頸就是如何對大量的細胞圖像進(jìn)行定量分析并且獲得具有統計學(xué)意義的數據—因為傳統的流式細胞儀無(wú)法獲得細胞的形態(tài)學(xué)信息，而采用熒光顯微鏡需要通過(guò)人為進(jìn)行判斷分析，統計的細胞數量非常有限。而美國Amnis公司推出的ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀完美的解決了這一問(wèn)題，能夠快速、客觀(guān)的對蛋白轉位、分子共定位、形態(tài)改變、分子內吞、免疫突觸形成等形態(tài)學(xué)進(jìn)行定量分析。