非成像式流式細胞儀的發(fā)展與應用

　　2.3? 分析和分選速度的提高

　　流式細胞儀非常重要的一個(gè)特點(diǎn)就是它能夠實(shí)現高速的細胞定量分析和目標細胞的分選。隨著(zhù)液流控制系統性能的改進(jìn)和光電檢測元件響應速度和計算機軟件系統的不斷發(fā)展進(jìn)步， 流式細胞儀的分析和分選速度都有質(zhì)的提高。目前，BD 公司出品的 FACSAria 流式細胞分選儀獲取速度可達 70000 個(gè)細胞 /s，分析速度可達 50000 個(gè)細胞 /s。這對于要通過(guò)對大量細胞的分析，建立不同細胞類(lèi)型的數據庫具有十分重要的現實(shí)意義，如根據細胞形態(tài)變化和內部結構的變化對腫瘤細胞進(jìn)行分類(lèi)等。

　　2.4? 實(shí)現多色分析

　　流式細胞儀另一個(gè)非常重要的特點(diǎn)就是它能夠實(shí)現對細胞的多參數測量。通過(guò)使用多種熒光標記物對細胞進(jìn)行標記，測量激光激發(fā)多色熒光信號，實(shí)現單次實(shí)驗對細胞多種成分測量。然而，實(shí)際中熒光標記物的發(fā)射光譜多較寬，不同的標記物標記細胞后，光電檢測器檢測到的熒光信號往往有重疊的現象，這就需要對熒光信號進(jìn)行補償。目前 BD 公司研發(fā)的細胞多色分析技術(shù)居于領(lǐng)先地位，它采用多根激光束同時(shí)激發(fā)流動(dòng)室中的一個(gè)細胞，激發(fā)出來(lái)的熒光信號分別經(jīng)過(guò)系統中的多個(gè)光學(xué)濾光片，被不同的光電檢測器檢測，這樣就可以解決熒光信號重疊的問(wèn)題，使多色分析達到最佳效果。BD 產(chǎn)品最多可進(jìn)行15 色熒光分析和前向、側向散射光分析，這樣單次實(shí)驗就可以同時(shí)獲得多達17個(gè)參數，提供豐富的細胞信息。

　　2.5? 儀器小型化?

　　低功耗、小型化、便攜式的細胞分析分選儀器，一直都是各大廠(chǎng)商和科研院所的研究方向。隨著(zhù)激光光源、光電檢測器件、電子計算機等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，器件的性能更加優(yōu)越，體積也更小，這使得流式細胞儀的小型化取得很大進(jìn)展。目前市場(chǎng)上的 C6 流式細胞儀的體積比小型微波爐還要小，重量不足 14kg，功耗也不超過(guò) 70W，是真正意義上的小型化分析儀器。

　　以 MEMS 技術(shù)（微機電系統）為基礎的微流控芯片（microfluidic chip） 技術(shù)具有體積小、效率高、集成度高、速度快等特點(diǎn)，為生化分析領(lǐng)域開(kāi)辟新的研究方向。國外課題組在這方面已經(jīng)做很多研究。Hirono 等人采用LED 作光源的微芯片流式細胞成像分析系統實(shí)現對血小板凝集數量的計數。Wolff 課題組研制一種微芯片細胞分選器，他們將激光光源、檢測器件和細胞的培養室統統集成到一個(gè)微型芯片上。該細胞分選器具有尺寸小、分選效率高、價(jià)格低等特點(diǎn)，同時(shí)采用封閉體系可以有效防止污染，滿(mǎn)足環(huán)保要求。國內方面也有很多課題組從事這方面研究。姚波等人采用靜電力的方法實(shí)現對細胞的篩選。當細胞經(jīng)過(guò)檢測區后，在芯片出樣管道的分支處被施加不同電壓，帶電荷細胞進(jìn)入出樣管道后，在靜電場(chǎng)力作用下，發(fā)生不同方向的偏轉，進(jìn)入到相應的收集管里，同時(shí)， 為有效消除電滲流影響， 他們還對管壁做涂層處理。

　　2.6? 儀器自動(dòng)化

　　以往流式細胞儀的使用都比較繁瑣，使用起來(lái)有相當的難度。隨著(zhù)計算機技術(shù)、自動(dòng)控制技術(shù)發(fā)展，目前流式細胞儀在進(jìn)樣、液流控制、多色熒光分析、細胞分選和數據處理等方面都已經(jīng)實(shí)現自動(dòng)化。例如 BD 公司的FACSAria 細胞分選儀配備液流自動(dòng)控制系統和軟件自動(dòng)清洗程序，實(shí)現進(jìn)樣倉自動(dòng)加壓、自動(dòng)混勻樣本、自動(dòng)沖洗進(jìn)樣管路、液滴監控、自動(dòng)檢查堵塞。系統軟件的分選設定和檢測功能大大簡(jiǎn)化操作， 實(shí)現細胞分選的無(wú)人操作。

　　3? 流式細胞儀的應用

　　隨著(zhù)各種新型的熒光染料和單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展應用，流式細胞儀在生物學(xué)和醫學(xué)領(lǐng)域的應用范圍得到進(jìn)一步的擴展。目前，基本上能進(jìn)行熒光分子標記的細胞或者亞細胞微粒都能被流式細胞儀檢測，下面簡(jiǎn)要介紹流式細胞儀在細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等部分領(lǐng)域的應用。

　　3.1? 在細胞生物學(xué)的應用

　　細胞內 DNA 的含量在整個(gè)細胞周期內隨時(shí)都發(fā)生周期性的變化，通過(guò)熒光探針對細胞內 DNA 含量進(jìn)行測量，能夠有效分析各個(gè)時(shí)相的細胞百分比以及 DNA 異倍體。相對于傳統染色體核型分析，流式細胞儀不僅能夠實(shí)現染色體分析還能進(jìn)行純化，以獲得克隆實(shí)驗所需的染色體。同時(shí)， 流式細胞儀因其具有高效分析和分選能力，在分子遺傳學(xué)中也有大量應用，主要是用于研究分離的染色體，以及對特定的染色體進(jìn)行分選。流式細胞儀在微生物領(lǐng)域的應用相對較晚，但它快速、多參數測量的特點(diǎn)十分適合解決微生物學(xué)面臨的一些問(wèn)題。目前，在工業(yè)上流式細胞儀能夠用于微生物的快速鑒定，例如對自來(lái)水中的微生物學(xué)鑒定和控制、對生乳中細菌總數的檢測等。

　　流式細胞儀在臨床醫學(xué)中最早應用于腫瘤學(xué)，主要是通過(guò) DNA 含量和線(xiàn)粒體數量檢測進(jìn)行癌前病變和早期癌癥的診斷以及化療指導和愈后評估等。流式細胞儀能夠精確檢測細胞內 DNA 含量，可對癌癥的性質(zhì)和發(fā)展趨勢進(jìn)行判斷，利于早期診斷。實(shí)際應用中需要將實(shí)體瘤組織解聚、分散制成單細胞懸液，并用熒光染料（碘化吡啶PI）染色，對細胞內的 DNA 含量進(jìn)行檢測。同時(shí)需要將不易區分的群體細胞分成 G1 期、S 期和 G2 期 3 個(gè)細胞亞群，DNA 的含量直接代表細胞的倍體狀態(tài)，腫瘤的惡性程度和非倍體細胞有密切關(guān)系。流式細胞儀還可對惡性腫瘤 DNA 倍體異質(zhì)體進(jìn)行檢測，對患者臨床分期、病理分級、腫瘤轉移具有重要意義。腫瘤早期診斷的一個(gè)重要依據就是 DNA 非整倍體細胞峰的存在。同時(shí)，細胞的 DNA 倍體分析也能夠用于病人愈后情況的早期判斷。異倍體腫瘤惡變的復發(fā)率和死亡率都比較高，然而，二倍體和近二倍體腫瘤的愈后狀況明顯比較好。流式細胞儀除能對癌癥 DNA 含量進(jìn)行分析外，還能夠根據癌癥 DNA 的分布直方圖變化情況對化療效果進(jìn)行評估，這對于癌癥的化療具有重要的指導意義。

　　3.3? 在免疫學(xué)中的應用

　　隨著(zhù)單克隆抗體技術(shù)、熒光色素技術(shù)的發(fā)展，流式細胞儀以其快速、定量測量的特點(diǎn)，被廣泛應用于免疫理論研究和臨床實(shí)踐當中。通過(guò)與熒光抗原抗體結合，對細胞表面和細胞內部的抗原、癌細胞基因蛋白定量分析，實(shí)現細胞分類(lèi)和亞群分析，這對于各種血液病、癌癥、B細胞淋巴瘤的早期診斷和治療以及對人體細胞免疫功能的評估都具有十分重要的現實(shí)意義。通過(guò)對患者淋巴細胞各個(gè)亞群數量的檢測可以了解淋巴細胞的分化功能，同時(shí)，通過(guò)對疾病的特異性淋巴細胞亞群或者細胞表面標記物的存在、缺失和過(guò)度表達等的研究，可以對一些免疫性疾病、 感染性疾病和腫瘤等進(jìn)行早期診斷和治療。 此外，還可以利用流式細胞儀進(jìn)行組織相容性抗原群體分析和器官移植和移植后免疫狀態(tài)監測。

　　3.4?在血液學(xué)中的應用

　　臨床中通過(guò)對外周血 T 淋巴細胞 、骨髓細胞表面抗原和細胞內DNA 含量的檢測，可以對包括白血病、淋巴瘤等多種血液病進(jìn)行早期診斷、及時(shí)治療和愈后情況的判斷。由于各類(lèi)血細胞都具有特異的抗原，流式細胞儀通過(guò)采用特異的抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，結合熒光染料，就可以測定某個(gè)細胞的多項參數，準確地判斷細胞屬性。流式細胞儀能夠在患者恢復期檢測體內是否還有殘留的病變細胞，這對于及早發(fā)現并采取有效措施防止白血病等疾病的復發(fā)具有極其重要的現實(shí)意義。上述應用只是流式細胞儀廣泛應用的一個(gè)縮影，流式細胞儀在細胞凋亡檢測、器官移植、精子性別控制、臨床細菌學(xué)、植物學(xué)等諸多領(lǐng)域都有十分廣泛的應用?？梢灶A見(jiàn)，隨著(zhù)激光、探測器、計算機技術(shù)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，流式細胞儀也將會(huì )有更加廣泛的應用前景。