New Phytol | 新突破！轉錄組+代謝組揭示機械脅迫調控油菜胚胎發(fā)育及成熟機制

文章導讀：

胚在種子內最初的自由擴張在某種程度上被與它接觸的種皮所抑制，導致其形成褶皺和邊界。但機械力似乎觸發(fā)并加速了種子的成熟。然而，這種效應的機制基礎仍不清楚。近日，德國萊布尼茨植物遺傳與作物植物研究所Ljudmilla Borisjuk課題組在New Phytologist上發(fā)表題為“Mechanical forces orchestrate the metabolism of the developing oilseed rape embryo”的研究論文。研究者油菜體內體外空間限制后，進(jìn)行磁共振成像和計算機圖形重建、免疫標記、流式細胞術(shù)、轉錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，揭示了機械力如何調控油菜胚胎發(fā)育并啟動(dòng)其成熟過(guò)程的證據。

研究結果

1 空間限制影響胚胎發(fā)生過(guò)程

發(fā)育10天的莢果上纏繞管子阻礙種子發(fā)育的擴張空間（圖1a，b）。研究發(fā)現，處理過(guò)的莢果中形成的胚胎比對照胚胎更早開(kāi)始變形，并且變形進(jìn)展更快（圖1c）。處理組莢果中發(fā)育的胚胎完全占據了可用空間時(shí)，非處理組莢果種子子葉仍在擴張。表明胚乳對空間限制的響應比胚胎早得多（圖1e），并且胚乳在空間受限的種子中更早停止擴張?？傮w結論是，減少胚胎擴張的空間會(huì )誘導其過(guò)早變形。

圖1空間限制對甘藍型油菜胚胎發(fā)生的影響

2.空間限制減少了胚胎中的細胞增殖

流式細胞術(shù)測定了機械壓力后15、20和25天種子胚的細胞數量。15-25的時(shí)間跨度從細胞快速增殖期結束一直延伸到細胞擴增期。在機械壓力15天時(shí)，處理胚胎和對照胚胎的細胞數量相似(圖2a)，到20天時(shí)，處理組細胞數量增加了一倍，對照組細胞數量增加了兩倍(圖2b)。這表明，限制胚胎的生長(cháng)會(huì )損害細胞的增殖。

圖2 空間限制條件下甘藍型油菜胚細胞增殖、基因表達及ABA含量

3.空間限制胚胎的轉錄組及代謝組分析

對機械壓力處理10和15天的處理組及對照組進(jìn)行轉錄組檢測。10天兩組樣本差異基因僅有3個(gè)，15天后增加至76個(gè)。GO富集分析顯示，機械限制導致處理組“細胞對缺氧的響應”下調，而“硫酸鹽同化”上調。受壓胚胎中與壓力相關(guān)的蛋白和細胞增殖相關(guān)的基因表達下調，而與硫代葡萄糖苷合成相關(guān)的基因表達上調。機械壓力增加了胚胎對硫的需求，這與儲存蛋白和硫代葡萄糖苷的合成有關(guān)。受壓胚胎中與細胞周期控制、氧化應激防御和ABA（脫落酸）信號傳導相關(guān)的基因表達上調。通過(guò)LC-MS分析發(fā)現，受壓胚胎中的ABA水平更高，與此一致的是，與ABA信號傳導相關(guān)的轉錄因子的表達也上調。盡管施加了機械壓力，但某些已知的機械感知相關(guān)基因的轉錄沒(méi)有受到影響。數據表明對胚胎施加機械約束的效果是抑制細胞周期活性，同時(shí)促進(jìn)儲存產(chǎn)物的合成/積累、ROS防御機制和ABA相關(guān)信號傳導。

對壓力處理5、10、15、20、25和30樣本進(jìn)行靶向和非靶代謝組檢測，檢出152種代謝物。處理影響了糖酵解途徑（圖3）。處理組15/20d胚胎中，果糖-1,6-二磷酸及其兩個(gè)裂解產(chǎn)物二羥丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸的水平都顯著(zhù)更高。處理組15d后，三酰甘油（TAG）合成前體甘油-3-磷酸（G3P）表達水平提高了九倍。機械限制15d后的胚胎進(jìn)行脂質(zhì)組檢測，鑒定出170種脂質(zhì)。壓力脅迫處理TAG含量比未受壓胚胎高17-38%。油酸（C18:1）和二十碳烯酸（C20:1）的含量增加，同時(shí)高飽和脂肪酸的比例降低?？臻g限制促進(jìn)了儲存脂質(zhì)的沉積開(kāi)始，但對其他脂質(zhì)類(lèi)別沒(méi)有影響。

圖3 空間限制條件下甘藍型油菜胚胎體內生長(cháng)的代謝組變化

4.空間限制胚胎的蛋白質(zhì)組檢測

對機械限制處理10，15天的種子分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組檢測。10d，處理組與對照組有61種蛋白存在差異；15d時(shí)，有25種差異?？臻g限制處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)儲存沉積，特別是某些特定蛋白質(zhì)（如RmlC-like cupins、種子儲存白蛋白4和十字花蛋白1）的含量顯著(zhù)增加。處理還影響了參與氨基酸合成、脂質(zhì)合成/儲存、糖類(lèi)代謝、ROS代謝和糖酵解的酶的蛋白質(zhì)含量。胚胎特異性、與質(zhì)膜相關(guān)的TRAF樣家族蛋白的積累受到抑制。一些差異積累的蛋白質(zhì)也在珠被或胚乳中表達，它們的差異豐度可能與機械壓力誘導的珠被和/或胚乳生長(cháng)過(guò)早停止有關(guān)。

圖4 空間限制甘藍型油菜種子蛋白質(zhì)組的變化

5.空間限制對體外培養胚胎生長(cháng)的影響

在子葉階段切除胚胎，并在不同體積特制球形培養室內培養，來(lái)研究種子對空間限制的響應?？臻g限制可以增加胚胎生物量和合成主要儲存產(chǎn)物的能力。生長(cháng)空間越小，胚胎就越小，其脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量就越高。在空間制條件下生長(cháng)的胚胎比未受阻礙生長(cháng)的胚胎更早且更多地積累脂質(zhì)

圖5 空間限制對甘藍型油菜胚離體培養生長(cháng)成熟的影響

6.空間限制體外培養胚胎轉錄組及代謝組分析

對3.5mm和5mm限制空間的培養室培養的胚胎進(jìn)行轉錄組測序。研究結果發(fā)現，與對照組相比，3.5mm有316個(gè)差異基因，5mm有446個(gè)。兩組差異表達的基因中有178個(gè)基因是共同的，這表明空間限制對胚胎基因表達有顯著(zhù)影響。GO富集分析發(fā)現，在機械限制下，光合作用顯著(zhù)下調。與細胞增殖、細胞板形成、胚胎極性和模式建立相關(guān)的基因的下調，以及與細胞分裂和分化調節相關(guān)的基因的下調，如BAM1和SERK1。流式細胞儀測量結果表明，機械應力的嚴重程度與胚胎細胞數量呈負相關(guān)，即空間限制導致細胞數量減少。與儲存化合物代謝促進(jìn)相關(guān)的基因表達上調，如編碼寡肽轉運體、谷氨酸脫氫酶、谷胱甘肽S-轉移酶和LEA蛋白的基因。淀粉合成的發(fā)育關(guān)閉，表現為顆粒結合淀粉合成酶基因表達的下降。熱休克蛋白（HSPs）基因的上調表明胚胎早熟，這是晚期種子成熟的標志。與水分調節相關(guān)的基因，如編碼水通道活性相關(guān)蛋白的PIP3A和PIP3C，以及TPS1（海藻糖-6-磷酸合成酶）基因的表達被抑制，這與成熟種子的脫水特征一致

?？臻g限制處理的代謝組檢測發(fā)現，空間限制促進(jìn)了能量豐富的核苷酸三磷酸和輔因子的積累，如維生素B6磷酸鹽、黃素單核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和有機酸（三羧酸循環(huán)的中間體）?？臻g限制導致短鏈脂肪酸、谷胱甘肽及其前體以及某些酚酸（包括苯甲酸，作為葉酸生物合成的前體）的積累，這些物質(zhì)與多種細胞功能相關(guān)?？臻g限制的胚胎中，兩個(gè)糖酵解中間體果糖-1,6-二磷酸和二羥丙酮磷酸的水平得到提升，表明糖酵解途徑受到影響?？臻g限制幾乎耗盡了所有游離氨基酸（除了天冬酰胺）和多胺（如瓜氨酸）、三甲胺、乳酸和抗壞血酸，這些都是細胞代謝的關(guān)鍵成分?？臻g限制導致乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸的水平顯著(zhù)升高?？傮w上，逐漸增加的機械限制在碳/氮（C/N）代謝上引起了特定變化，尤其是在核苷酸、輔因子和氧化還原代謝方面。這些發(fā)現表明，空間限制對胚胎的代謝途徑有顯著(zhù)影響，特別是在能量代謝和儲存化合物的合成上。

圖6 代謝途徑圖顯示了體外培養的甘藍型油菜胚胎代謝產(chǎn)物豐度的變化

研究結論

本文對影響油菜胚胎體內或體外生長(cháng)的機械約束的操作與分析方法相結合，包括磁共振成像和計算機圖形重建、免疫標記、流式細胞術(shù)、轉錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析。數據表明，在體內，施加機械約束阻礙了種皮和胚乳的擴張，導致胚胎變形。胚胎發(fā)育的加速意味著(zhù)細胞增殖的停止和脂肪和蛋白質(zhì)儲存的刺激，這是胚胎成熟的特征。潛在的分子特征包括細胞周期控制、活性氧代謝和轉錄重編程，以及糖酵解通量的變構控制?？s小體外生長(cháng)的胚胎的生長(cháng)空間也引起了類(lèi)似的反應。結論是，對發(fā)育中的油菜胚胎的生長(cháng)施加機械約束是其成熟的重要觸發(fā)因素。