基于多通道抗凝血藥物篩選檢測儀的研制

介紹一種以透射比濁法為設計原理，單片機89C52為核心的96通道高速抗凝血藥物篩選平臺。

該儀器自動(dòng)完成血液（血漿）凝血時(shí)間的實(shí)時(shí)檢測及數據采集，數據采集的精度、速度及靈敏度較傳統的凝血時(shí)間測量?jì)x器有較大的提高。提出了將凝血時(shí)間測量用于相關(guān)藥物篩選的新途徑。

血液凝固的過(guò)程非常復雜的。生物體在正常生理狀態(tài)下，血液中的凝血系統與抗凝血系統處于自我調節的一種平衡狀態(tài)，如果這種平衡被破壞，就會(huì )形成凝血系統疾病?，F在臨床上最常用的抗凝血類(lèi)藥物是肝素，這種藥物雖然有很好的抗凝血效果，卻伴隨著(zhù)血和血小板減少等副作用，而且當患者本身患有彌散性血管內凝血等疾病時(shí)便無(wú)法采用?，F有的口服類(lèi)抗凝血藥物（如節丙酮香豆素[1]）的使用效果又不甚理想。因此，新型抗凝血藥物的研制工作是非常必要的。

進(jìn)行抗凝血藥物開(kāi)發(fā)的第一步就是要檢驗藥物的抗凝效果，也就是凝血時(shí)間的檢測?，F在際上普通認可的測量凝血時(shí)間的指標主要有兩個(gè)：凝血酶原時(shí)間（Prothrombin Time,PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（Actived Partial Thromboplastin Time,APTT）。這兩個(gè)指標是

由國際血液學(xué)標準化委員會(huì )（ICSH）、估計血檢與止血委員會(huì )（ICTH）和美國臨床檢驗標準委員會(huì )（NCCLS）聯(lián)合制定分布的[2]。PT和APTT不僅能取代傳統的Duke法出血時(shí)間和玻片法凝血時(shí)間而作為新的臨床止血功能指標，并且能為抗凝血藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程提供更好的監控指標。

正常的凝血過(guò)程時(shí)間很短，即使加入抗凝劑，也不會(huì )超過(guò)1分鐘。正常情況下，PT不會(huì )超過(guò)20秒，這給手工測量帶來(lái)了很大的困難。為了尋求方便的檢測途徑，國內外許多企業(yè)已經(jīng)開(kāi)始研制相關(guān)的自動(dòng)化凝血時(shí)間測量?jì)x，并且已經(jīng)投

放市場(chǎng)如德國TECO公司的TEChrom IV plus 4通道半自動(dòng)血栓/止血測定儀；法國B(niǎo)IOCHEM公司STAGO全自動(dòng)血栓/止血分析儀等。這些凝血測量?jì)x雖然可以完成一個(gè)或幾個(gè)樣品的同時(shí)檢測，但是仍然沿用臨床檢測的套路，檢測速度有限，樣品用量比較大，樣品波大都固定于儀器上，清洗不方便，同時(shí)價(jià)格也相當昂貴，不適用于藥物開(kāi)發(fā)。

為了提高凝血測量?jì)x的性能，同時(shí)滿(mǎn)足高通量的藥物篩選的需求，我們利用單片機設計了一套新型的凝血時(shí)間自動(dòng)檢測儀，目的在于為新藥開(kāi)發(fā)質(zhì)量控制提供便利。這臺小型的凝血時(shí)間測量裝置（體積僅30cm×20cm×12cm）不僅能夠進(jìn)行96路并行實(shí)時(shí)檢測，而且樣品用量少（20μl），靈敏度高（0.1秒），具有很好的應用前景。

1 測量原理

血液的凝固從物理上來(lái)講就是非溶性纖維蛋白形成的過(guò)程，而且在很短的時(shí)間內非溶性纖維蛋白的數量會(huì )陡然增加。這樣，整個(gè)血液的透光率就會(huì )迅速降低（濁度升高），一段時(shí)間后就會(huì )漸漸變緩。通常我們所測量的凝血時(shí)間也就是指非溶性纖維蛋白形成的起始階段，即濁度變化達到三倍信澡比的時(shí)間。

透射比濁法正是利用了血液在凝血過(guò)程中濁度突然升高的原理來(lái)設計的。只要檢測器件具有足夠的靈敏度，就可以檢測出血液凝固的時(shí)間。

2 檢測儀設計

2.1 樣品池設計

檢測儀采用標準平底透明96孔板作為樣品池，其上、下方分別為一一對應光敏二極管和發(fā)光二極管，樣品池采用抽屜式結構。每次使用可以將抽屜拉出，放上96孔板，再加入凝血試劑和血液（血漿），然后啟動(dòng)檢測開(kāi)關(guān)，開(kāi)始數據采集。

2.2 電路設計

由于通過(guò)光敏二極管接收到的電壓信號變化量往往比較低（幾個(gè)mV），對于光源手檢測器件的選擇至關(guān)重要的。因此，在儀器設計以前，首先選用了幾個(gè)不同的發(fā)光二極管（以下簡(jiǎn)稱(chēng)LED）和與其對應的光敏二極管對凝血過(guò)程透光率進(jìn)行了實(shí)測相應的理論計算。

圖1所示為光敏二極管的基本電路。二極管兩端的電流為：

式中，I為通過(guò)不敏二極管的電流，Is為反向飽和電流，VD為二極管兩端電壓，VT=kT/q稱(chēng)為混度進(jìn)行當量，其中k為玻爾茲曼常數，T為熱力學(xué)溫度，q為電子的電量。在300K時(shí)，VT≈26mV。反向偏置時(shí)，只要|VD|大于VT幾倍以上，I=-Is，其中負號表示反向電流。

實(shí)驗證明，光敏二極管的反向電流在一定范圍內與LED上的加載電壓存在正比的函數關(guān)系，如圖2所示。這是因為L(cháng)ED正常發(fā)光過(guò)程中，LED加載電壓與輸出光強存在正比關(guān)系；光敏二極管的反向電流與其吸收光強也存在正比的函數關(guān)系。根據這一點(diǎn)我們可以做如下推斷：

假設通過(guò)光敏二極管的吸收光強為φ，則

I=-Is=Cφ+m≈Cφ

其中，C與m為僅隨溫度而變化的因子，m≈0。

與光敏二極管串聯(lián)的電阻R兩端電壓V=IR=CφR，并有：φ=φ0+Δφ，V=V0+ΔV,V0=CRφ0, ΔV=CRΔφ。其中，V0和φ0為凝血反應開(kāi)始之前R電阻兩端的電壓與光敏二極管的吸收光強