復旦校友揭開(kāi)二十年來(lái)“不明”機理，獲得穩定的DNA損傷反應與修復核心激酶抑制劑，為相關(guān)抗癌****設計指明方向

他本科就讀于復旦大學(xué)，期間參加復旦和伯明翰大學(xué)的“2+2”聯(lián)合培養，獲一等榮譽(yù)學(xué)位畢業(yè)后，赴劍橋大學(xué)攻讀博士學(xué)位，師從生物化學(xué)系教授湯姆·布倫德?tīng)柧羰浚⊿ir Tom Blundell）。博士畢業(yè)以來(lái)，一直在該課題組留任博后。
布倫德?tīng)柧羰渴侨蚪Y構生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的先驅之一，亦是最早運用蛋白結構和生物信息分析來(lái)指導小分子****物開(kāi)發(fā)設計和優(yōu)化的結構生物學(xué)家。他于 1984 年當選英國皇家學(xué)會(huì )會(huì )員，1996 年到 2009 年擔任劍橋大學(xué)生物化學(xué)系主任，曾任英國科學(xué)委員會(huì )主席。

2022 年 1 月 5 日，由梁世康和布倫德?tīng)枔喂餐ㄓ嵶髡叩恼撐?，以題為《DNA修復蛋白 DNA-PKcs 抑制劑調控的結構見(jiàn)解》（Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs）發(fā)表在 Nature[1]。
梁世康指出，過(guò)去二十年以來(lái)學(xué)術(shù)界和制****界一直未能很清楚了解的小分子抑制劑和人體 DNA 損傷修復核心蛋白激酶（DNA-PKcs）的作用機理。
論文揭示了相關(guān)機理分子水平的細節，這為相關(guān)抗癌****物的設計提供了明確方向指導，也揭示了配體結合對于 DNA-PKcs 后續催化反應的促進(jìn)效果，同時(shí)在基于結構的****物開(kāi)發(fā)和設計上再次展現出冷凍電鏡的重要潛力。

DNA 依賴(lài)蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）在非同源端連接中起著(zhù)重要作用，這是人類(lèi)檢測和修復 DNA 雙鏈斷裂（DSBs）的兩種主要途徑之一。

DNA-PKcs 在修復病理性 DSBs 中具有重要作用，結合 DSBs 誘導的放療和化療，DNA-PKcs 抑制劑已成為很有吸引力的癌癥治療****物。目前，已開(kāi)發(fā)的許多 DNA-PKcs 選擇性抑制劑在治療各種癌癥方面具有潛力。

該研究報道了從 HeLa 細胞核提取物中純化的天然人類(lèi) DNA-PKcs 與不同配體復合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構。這些配體包括腺苷-5'-（-硫代）-三磷酸鹽（ATPγS）和四種抑制劑（渥曼青霉素、NU7441、AZD7648 和 M3814），其中包括正在進(jìn)行臨床 I、II 試驗的候選****物。

而該結構揭示了配體在 ATP 位點(diǎn)結合的分子細節，并提供了對競爭抑制劑的作用模式和特性的見(jiàn)解。值得注意的是，配體的結合導致 PIKK 調控域（PRD）發(fā)生移動(dòng)，揭示了 p 環(huán)和 PRD 構象之間的連接。

電泳遷移率測定和 cryo-EM 對 DNA 依賴(lài)蛋白激酶全酶的研究進(jìn)一步表明，配體結合對全酶復合物的組裝沒(méi)有負面的變構或抑制作用，抑制劑通過(guò)與 ATP 直接競爭發(fā)揮作用。

作為細胞信號傳導的主要調控者， 蛋白激酶的相關(guān)制****在各個(gè)疾病領(lǐng)域尤其是癌癥上，展現出驚人療效和巨大潛力。

DNA-PKcs 作為人體 DNA 損傷反應與修復的核心激酶，更是延緩和治療癌癥的重要靶點(diǎn)。抑制 DNA-PKcs 活性可以阻斷相關(guān) DNA 修復通路，加速紊亂癌細胞的基因組來(lái)殺死癌細胞。

此外，對于通過(guò)破壞癌細胞基因組穩定來(lái)殺死癌細胞的治療方式、比如放療和化療來(lái)說(shuō)，抑制 DNA-PKcs 活性還能加強治療效果。

因此，學(xué)術(shù)界和制****界一直在針對 DNA-PKcs 的抑制劑進(jìn)行研發(fā)。尤其是制****公司通過(guò)高通量篩選和****物分子優(yōu)化設計，開(kāi)發(fā)出了第一代和第二代特異性抑制劑，并已有數個(gè)小分子****物進(jìn)入臨床 I、II 期試驗。

然而，因為蛋白自身大小、靈活度、穩定性和取向偏好等因素，在晶體時(shí)代和自冷凍電鏡革命以來(lái)，其相關(guān)結構研究進(jìn)展緩慢，一直無(wú)法獲得蛋白和抑制劑相互作用的高分辨率結構信息。

基于該問(wèn)題，梁世康運用冷凍電鏡，在添加自制單層氧化石墨烯薄膜作為基底和優(yōu)化實(shí)驗條件之后，獲得了穩定的 DNA-PKcs/抑制劑復合物，并解析出了相關(guān)高解析度結構。

通過(guò)天然配體/廣譜抑制劑/第一、二代特異性抑制劑，與 DNA-PKcs 相互作用機理的縱向比較，結合其同源激酶家族成員、與配體和抑制劑相互作用機理的橫向比較，他們首次得以從分子層面闡釋 DNA-PKcs 抑制劑特異性差異的原因，并為新一代抑制劑的設計和優(yōu)化提供了指導思路。


不僅如此，各種配體在同一結合位點(diǎn)的不同作用方式，也揭示出 DNA-PKcs 催化中心內部不同結構域之間的協(xié)同運動(dòng)，展現出配體對底物結合的促進(jìn)作用，這也幫助梁世康進(jìn)一步了解相關(guān)催化機理。

總的來(lái)說(shuō)，該研究中描述的結構將極大地幫助未來(lái)靶向 DNA-PKcs 的合理****物設計，展示 cryo-EM 在結構引導的大型和挑戰性目標****物開(kāi)發(fā)中的潛力。

選擇和努力一樣重要，這同樣適用于科研圈。正因為梁世康選擇了布倫德?tīng)?，布倫德?tīng)栠x擇了他，才有了今天的成果。

多年以來(lái)，布倫德?tīng)柦淌诔掷m關(guān)注研究人體 DNA 雙鏈斷裂修復的相關(guān)結構機理。2001 年，該實(shí)驗室開(kāi)始 DNA-PKcs 相關(guān)的結構研究，2009 年率先得到 DNA-PKcs 的晶體，并解析出 6.6? 的蛋白結構 [2]。

2017 年，在優(yōu)化結晶條件和使用硒代蛋氨酸標記的基礎上，該團隊成功解析出 4.3? 的晶體結構，成功提出第一個(gè) DNA-PKcs 的原子結構模型[3]。

梁世康回憶稱(chēng)，剛進(jìn)實(shí)驗室讀博時(shí)，他的課題是運用晶體衍射的方法，來(lái)研究包括蛋白-蛋白和蛋白-配體在內的、與 DNA-PKcs 相關(guān)的蛋白復合物。

但是由于相關(guān)蛋白表達難、無(wú)序度高、穩定性低、提純復雜以及產(chǎn)量低，結晶難等一系列挑戰因素，讓其早期研究進(jìn)展非常緩慢。

他說(shuō)：“有時(shí)做了整整一周的蛋白純化，卻只能拿到幾百微克的蛋白樣品，只夠測試和優(yōu)化很少的實(shí)驗條件?！?br />
在不停做實(shí)驗的同時(shí)，他也不斷地跟導師、實(shí)驗室前輩和同事探討，并通過(guò)閱讀文獻不斷“充電”。在導師的信任和支持下，他積極拓展研究方法，開(kāi)始運用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)。

其表示：“讓我很難忘的，是解出 DNA-PKcs/NU7441 復合物結構也是第一個(gè) DNA-PKcs / 配體復合物結構的那天晚上?！?/span>
不同于多蛋白組分復合物可在電鏡下、或二維投影里直接看出結合伴侶是否存在，因為配體是小分子，在得到三維結構之前，很難判斷其是否作用在結合位點(diǎn)上。

由于之前不少?lài)L試都不盡如人意，在計算機上分析這套數據時(shí)，梁世康已經(jīng)開(kāi)始思考接下來(lái)可行的優(yōu)化實(shí)驗和具體安排。

而在得到三維結構之后，當他在結合位點(diǎn)里清楚看到來(lái)自配體的信號的那一刻，他十分欣喜，這意味著(zhù)能以此為基礎，來(lái)研究其他特異性不同的抑制劑和 DNA-PKcs 的相互作用。

對于該研究的應用價(jià)值，他說(shuō)：“最直接、最明顯快速的應用前景，在于可指導新一代針對 DNA-PKcs 的小分子激酶抑制劑的設計。”

在獲悉抑制劑和蛋白的作用機理，也通過(guò)一系列橫向與縱向對比，弄清楚抑制劑特異性的來(lái)源之后，即可結合生物信息分析****物靶點(diǎn)的結構特性，去設計特異性更好、與結合位點(diǎn)更適配的小分子抑制劑。

說(shuō)到這里他表示：“我們發(fā)表并公開(kāi)了所有相關(guān)結構，這樣不僅是我們課題組，全世界其他研究小組和制****公司都可使用此次發(fā)布的結構信息，來(lái)優(yōu)化和指導已有小分子****物。雖然離讓廣大病患使用到具體****物還有很長(cháng)一段路，但這無(wú)疑可以加速相關(guān)抗癌****物的研發(fā)，助力未來(lái)造?；颊??！?br />
不僅如此，該研究也是一個(gè)很好的概念驗證，對于 DNA-PKcs 這種頗具挑戰性的蛋白來(lái)說(shuō)，證明了運用冷凍電鏡來(lái)做基于結構的****物設計是可行的。

除傳統小分子激酶抑制劑和****物靶點(diǎn)之外，借助該研究也可關(guān)注其他類(lèi)型****物 ，比如蛋白降解靶向嵌合體、以及多肽和其他結合位點(diǎn)。
相比目前已成熟的傳統激酶抑制劑研究，盡管這些發(fā)展和應用更加耗時(shí)耗力，成本也相對高昂，但是****物發(fā)展充滿(mǎn)各種可能性，值得積極嘗試。

接下來(lái)，梁世康也會(huì )牽手合作團隊，探究新一代抑制劑的優(yōu)化，以追求更好的特異性和結合強度，并將繼續深耕人體 DNA 損傷反應與修復以及相關(guān)新型****物分子的開(kāi)發(fā)。

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參考：
1、Liang, S. et al. Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs. Nature (2022) DOI: 10.1038/s41586-021-04274-9
2、Sibanda, B. L., Chirgadze, D. Y., & Blundell, T. L. Crystal structure of DNA-PKcs reveals a large open-ring cradle comprised of HEAT repeats." Nature 463.7277 (2010): 118-121.
3、Sibanda, B. L., Chirgadze, D. Y., Ascher, D. B., & Blundell, T. L. DNA-PKcs structure suggests an allosteric mechanism modulating DNA double-strand break repair. Science（2017）：355(6324), 520-524.