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熒光顯微鏡檢測原理及方法
作者：
時(shí)間：2013-03-05
來(lái)源：網(wǎng)絡(luò )
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（六）目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過(guò)去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀(guān)察很方便。
（七）落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后，波長(cháng)短的部分（紫外和紫藍）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長(cháng)長(cháng)的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見(jiàn)光長(cháng)波區，可透過(guò)濾鏡而到達目鏡觀(guān)察，熒光圖像的亮度隨著(zhù)放大倍數增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀(guān)察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱(chēng)之為落射熒光顯微鏡。
二、熒光顯微鏡標本制作要求
（一）載玻片
載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
（二）蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長(cháng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò)，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標本。
（三）標本
組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀(guān)察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。
（四）封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去 。所以，常用甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。
（五）鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀(guān)察標本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。
三、使用熒光顯微鏡的注意事項
（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。
（2）應在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開(kāi)始觀(guān)察標本。
（3）防止紫外線(xiàn)對眼睛的損害，在調整光源時(shí)應戴上防護眼鏡。
（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線(xiàn)照射3～5
min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過(guò)2～3h。
（5）熒光顯微鏡光源壽命有限 ，標本應集中檢查，以節
省時(shí)間，保護光源。天熱時(shí)，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應避免數次點(diǎn)燃光源。
（6）標本染色后立即觀(guān)察，因時(shí)間久了熒光會(huì )逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。
（7）熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光?！?”—僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光?！?+”—可見(jiàn)有明亮的熒光?！?++”—可見(jiàn)耀眼的熒光。
四、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時(shí)，必須將二者結合起來(lái)綜合判斷。結果記錄根據主觀(guān)指標，即憑工作者目力觀(guān)察。作為一般定性觀(guān)察，基本上可靠的。隨著(zhù)技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀(guān)指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀(guān)的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術(shù)對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統裝置。(end)
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