高效液相色譜儀操作三要點(diǎn)

　　一、脫氣

　　流動(dòng)相脫氣對于避免HPLC系統出問(wèn)題，順利得到一個(gè)理想的數據是一個(gè)很有效的措施。HPLC系統內是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時(shí)要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當氣泡存在時(shí)，你將觀(guān)察到瞬間的流速降低和系統壓力下降。如果這個(gè)氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預先設定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設計可以很好地排除氣泡，而也有一些泵設計當氣泡存在時(shí)將停止運轉。

　　當一個(gè)氣泡通過(guò)輸液泵時(shí)，由于系統壓力大，氣泡通常會(huì )溶解在流動(dòng)相溶液中，隨流動(dòng)相通過(guò)柱子。但是到達檢測器流通池時(shí)系統壓力又恢復到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現，在色譜圖上會(huì )出現不規律的毛刺。為解決這個(gè)問(wèn)題，有些儀器公司設計一個(gè)反壓控制器，這樣可以在檢測器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動(dòng)相中直到它們流出檢測器。當然，這個(gè)壓力不能超過(guò)流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測器。

　　紫外/可見(jiàn)光（UV/VIS）檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過(guò)流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也非常敏感，但表現出的征兆與UV/VIS不同，例如有報導說(shuō)，當使用熒光（FL）檢測器時(shí)，流動(dòng)相中溶解氧的存在可能會(huì )使一些化合物失去熒光性。此外，對于利用待測物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應引起電流變化而進(jìn)行檢測的電化學(xué)（EC）檢測器，對流動(dòng)相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時(shí)還會(huì )導致保留時(shí)間不重現。

　　所以，必須注意消除流動(dòng)相中的空氣，并且還應避免空氣由管路（如PTFE管）滲透進(jìn)流動(dòng)相中。

　　如果適當地關(guān)注在使用之前脫去流動(dòng)相中溶解進(jìn)的空氣，上述這些問(wèn)題均能避免，或把影響降至最低。常用的脫氣方法有如下幾種：

　　1. 吹氦脫氣法。利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60 mL/min流速通入流動(dòng)相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動(dòng)相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個(gè)高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動(dòng)相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著(zhù)1L氦氣通過(guò)1L流動(dòng)相就可完成排氣這個(gè)工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國內氦氣價(jià)格較高，很少有實(shí)驗室采用此方法。

　　2. 加熱回流法。此法的脫氣效果較好。在操作時(shí)要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會(huì )丟失，混合流動(dòng)相的比例會(huì )有變化。

　　3. 抽真空脫氣法。此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會(huì )使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實(shí)驗的重現性，因此多用于單溶劑體系的簡(jiǎn)單分析。

　　4. 超聲波脫氣法。將欲脫氣的流動(dòng)相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果最差。

　　5. 在線(xiàn)脫氣法?，F在商品的HPLC儀器，均可配在線(xiàn)脫氣機。在線(xiàn)脫氣使用簡(jiǎn)單，低故障，有效。建議購買(mǎi)儀器時(shí)一定要購買(mǎi)，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時(shí)應與公司確認。

　　二、過(guò)濾

　　任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統后都會(huì )在柱子入口端被篩板擋住，最后的結果是將柱子堵塞，表現出的特征是系統壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過(guò)濾設計，努力防止或減少顆粒物進(jìn)入HPLC系統中，從而延長(cháng)儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數據的可靠性。在HPLC系統中，顆粒物的主要來(lái)源有三個(gè)途徑：流動(dòng)相、被測樣品和儀器系統部件的磨損物。

　　1、流動(dòng)相

　　如果流動(dòng)相均由高效液相色譜級溶劑組成，流動(dòng)相沒(méi)有必要過(guò)濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過(guò)程中都已經(jīng)過(guò)了0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾。同樣的，無(wú)論你是買(mǎi)的HPLC級的水還是在實(shí)驗室使用超純水凈化系統制備的水，最后一步也是通過(guò)0.2 μm微孔濾膜。然而，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸鹽，流動(dòng)相過(guò)濾將是必要的一個(gè)步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內蓋時(shí)，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會(huì )產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能完全溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動(dòng)相中成為殘渣。

　　流動(dòng)相通過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾對于從流動(dòng)相中除去所有顆粒物是一個(gè)有效方法。0.2 μm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個(gè)應用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過(guò)濾速度會(huì )更慢，特別是當實(shí)驗室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時(shí)。建議實(shí)驗室在編寫(xiě)制定他們流動(dòng)相制備標準操作程序（SOPs）時(shí)規定，可以借鑒國際上同類(lèi)實(shí)驗室的規定，即：

　　流動(dòng)相制備僅采用HPLC級液體時(shí)不需要過(guò)濾，反之所有流動(dòng)相組成在使用前必須過(guò)濾。

　　在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過(guò)濾器（常見(jiàn)材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個(gè)過(guò)濾器的規格為≥10 μm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動(dòng)相過(guò)濾步驟，但是它能除去系統中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。