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利用RRLC改善西洋參HPLC的分離速度和靈敏度
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時(shí)間：2013-05-07
來(lái)源：網(wǎng)絡(luò )
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本文以中國藥典的HPLC方法為起點(diǎn)，利用快速高分離度液相色譜（RRLC）對西洋參中活性組分Rg1、Re、Rb1進(jìn)行快速、有效的分離。該方法在保持分離度和重現性的前提下，改善了分析靈敏度，大大縮短了分離時(shí)間。另外，使用相同RRLC系統和與RRHT色譜柱相同鍵合相的ZORBAX SB C18 HPLC色譜柱，也獲得了滿(mǎn)意的HPLC分離結果。
概述
西洋參（又名花旗參）系五加科植物西洋參（Panax quinquofolimm L.）的干燥根，西洋參的根部及地上莖葉部分含有多種生理活性成分，其中主要是西洋參皂甙和三萜類(lèi)化合物，三萜類(lèi)化合物與人參皂甙結構相似。西洋參皂甙是西洋參中主要的有效成分，也是生理活性最顯著(zhù)的物質(zhì)。其中人參皂苷的Rb1又是西洋參主要特征成分，其含量高于人參，也是西洋參與人參鑒定的主要依據。
在2005版中國藥典一部中，西洋參活性成分的含量測定采用了以十八烷基鍵合硅膠為填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的液相色譜分析方法。該方法主要需要分離人參皂苷Rg1、Re與Rb1，因3個(gè)化合物結構相似，尤其是Rg1和Re（見(jiàn)圖1），故HPLC需要利用長(cháng)時(shí)間的淺梯度分離。3個(gè)色譜峰的HPLC分離時(shí)間需要約60min，分離一次的運行時(shí)間長(cháng)達120min。本研究是在中國藥典HPLC梯度方法的基礎上，選擇合適的鍵合相填料，開(kāi)發(fā)以小顆粒填料技術(shù)為基礎的RRLC方法，在滿(mǎn)足分離度要求的前提下，實(shí)現快速、靈敏、可重現的方法學(xué)目標。 
圖1 人參皂苷的結構
在2005版中國藥典一部中，西洋參活性成分的含量測定采用了以十八烷基鍵合硅膠為填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的液相色譜分析方法。該方法主要需要分離人參皂苷Rg1、Re與Rb1，因3個(gè)化合物結構相似，尤其是Rg1和Re（見(jiàn)圖1），故HPLC需要利用長(cháng)時(shí)間的淺梯度分離。3個(gè)色譜峰的HPLC分離時(shí)間需要約60min，分離一次的運行時(shí)間長(cháng)達120min。本研究是在中國藥典HPLC梯度方法的基礎上，選擇合適的鍵合相填料，開(kāi)發(fā)以小顆粒填料技術(shù)為基礎的RRLC方法，在滿(mǎn)足分離度要求的前提下，實(shí)現快速、靈敏、可重現的方法學(xué)目標。
RRLC方法轉換和優(yōu)化
快速高分離度液相色譜（RRLC， Rapid Resolution Liquid Chromatography）利用亞二微米小顆粒填料分離的液相色譜技術(shù)，與常規較大顆粒（如5mm）不同，小顆?？梢燥@著(zhù)改善液相色譜的分離度、分離速度和靈敏度。因RRLC分離常常使用與HPLC不同的儀器和色譜柱，故在RRLC分離時(shí)需要對原始HPLC分離條件進(jìn)行適當的調整或優(yōu)化。
色譜柱的選擇
因流動(dòng)相中含有磷酸，RRLC分析采用內含1.8小顆粒的ZORBAX StableBond C18色譜柱。該填料在低pH條件下具有杰出的穩定性，是低pH條件液相色譜分離的首選。色譜柱規格選擇了4.6×50mm的RRHT色譜柱，其柱長(cháng)與粒徑之比（L/dp≌28）與規格為4.6×150 mm， 5的常規HPLC色譜柱相當（L/dp=30），故可以獲得相近的分離效率，但分離速度大大提高，并且可以改善靈敏度。
色譜柱內徑的選擇主要考慮方法轉換的方便性，選擇與HPLC色譜柱相同內徑的RRHT色譜柱可以降低方法轉換的可變性。本方法采用了與HPLC色譜柱相同內徑（4.6mm）的RRHT色譜柱。如選用更小內徑的色譜柱，可以在保持線(xiàn)速度相同的前提下獲得相同的分離結果，并進(jìn)一步降低溶劑消耗。
方法轉換的初步參數確定
在Method Translator相應欄目中輸入原始HPLC條件，包括HPLC色譜柱規格、進(jìn)樣量、流速、梯度表等參數，并選擇RRLC色譜柱的規格，即可獲得根據洗脫柱體積相同原則折算而得的RRLC分離的初步參數。
因小顆粒填料在較高的線(xiàn)速度下可以保持柱效（分離度），故可以通過(guò)提高流速的方式進(jìn)一步提高分離速度。如需保持分離度相同，則在流速調整時(shí)要保持流速與梯度時(shí)間乘積不變，即提高流速的同時(shí)等比縮短梯度時(shí)間。本研究根據中國藥典一部中給定的西洋參梯度分離條件和上述原則，確定了初始實(shí)驗條件。
方法優(yōu)化
起始試驗條件雖然獲得了與藥典原始HPLC方法相似的RRLC分離譜圖，但因色譜柱選擇性的差異等影響，并沒(méi)能基線(xiàn)分離結構相近的目標化合物Rg1與Re。因此，方法需要進(jìn)行進(jìn)一步摸索與優(yōu)化。適當降低流動(dòng)相在Rg1與Re出峰附近的洗脫強度，兩色譜峰的分離度獲得了初步改善，但仍未實(shí)現基線(xiàn)分離?？紤]到溫度對分離選擇性的可能影響，嘗試設置不同柱溫考察分離選擇性的變化。原始中國藥典的方法所用柱溫為40℃，本實(shí)驗在原始條件的基礎上，又分別在25℃和30℃下進(jìn)行了分離（見(jiàn)圖2）。 
圖2 不同溫度下，Rg1與Re的分離度比較
從實(shí)驗結果得知：降低溫度有利于Rg1與Re的分離，25℃時(shí)Rg1和Re可以得到基線(xiàn)分離（分離度>2.0）（見(jiàn)圖3），故最終選擇25℃為柱溫條件。最終優(yōu)化獲得的分離條件可以在11min內基線(xiàn)分離3個(gè)目標皂苷（分離度>2.0），加上洗脫保留較強雜質(zhì)與平衡時(shí)間，一次運行總時(shí)間為20min，分離速度是原來(lái)HPLC分離速度（120min）的6倍，溶劑消耗也相應降低了。 
圖3 西洋參中人參皂苷的RRLC分離結果
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