硅光電倍增管（SiPM）：新奇的光電生物傳感器

SiPM：新奇的光電生物傳感器

傳感器變送與應用

摘要 — 很多種生物應用都涉及熒光技術(shù)。特別是在DNA-Chip光學(xué)檢測中，熒光團與靶分子(待測分子)結合，再與探針(錨定在玻片上的一個(gè)DNA鏈)雜交，然后使用光學(xué)掃描儀檢測DNA。本文的目的是推薦使用一個(gè)新奇的傳感器替代傳統檢測系統，該傳感器基于硅光電倍增管或SiPM，即將若干個(gè)固態(tài)光電檢測器排成像素陣列;另一個(gè)目的是研究新型熒光染料。硅光電倍增管由像素數量不同(25-400個(gè)像素)的陣列組成，用于在各種溶液中檢測CY5和Ru(bpy)32+染料的熒光，為硅光電倍增管在DNA-Chip測量中的應用創(chuàng )造了機會(huì )。

I. 前言

硅光電倍增管(SiPM)是一種創(chuàng )新的Geiger模式的固態(tài)光電檢測器。硅光電倍增管結構是若干個(gè)相等的單個(gè)像素并排組成的陣列，每個(gè)像素都是一個(gè)集成降壓電阻的硅p-n結雪崩光電二極管(SPAD) [1]。所有像素都并聯(lián)至一個(gè)統一的輸出點(diǎn)，因此，輸出信號是各個(gè)像素產(chǎn)生的信號的總合，并與光子碰撞的單元數量成正比[2]。硅光電倍增管是一個(gè)很有前景的光電檢測解決方案，可代替傳統光電倍增管(PMT)，該技術(shù)的某些特性引起人們的興趣，例如，對磁場(chǎng)不敏感的特性使之適用于強磁場(chǎng)工作環(huán)境;穩健性和可靠性高于傳統光電倍增管;工作電壓更低，價(jià)格更便宜，反應速度更快，尺寸更小。高速[3]、高靈敏度和小尺寸讓硅光電倍增管成為最佳的便攜應用光電檢測器。當然，在各種應用領(lǐng)域，生物傳感器是最令人期待的目標應用，不過(guò)，作為熒光檢測器，硅光電倍增管被推薦用于生物傳感器的文獻并不是很多[4-5]?；贒NA-Chip的解決方案通過(guò)熒光測量方法同時(shí)測定大量基因的表達量[6]。CY3和CY5(發(fā)射波長(cháng)分別為570 nm和670 nm)是標記DNA目標的傳統熒光團。本文探討了CY5參考標記熒光團和Ru(bpy)32+創(chuàng )新熒光團。其中，Ru(bpy)32的某些獨有特性使其可以替代傳統熒光團，成為新的備用熒光團。事實(shí)上，該熒光團的最大吸收波長(cháng)和最大發(fā)射波長(cháng)分別為450 nm (金屬配體轉移)和630 nm [7]，這一間隔范圍可簡(jiǎn)化熒光檢測器設計，準許使用價(jià)格低廉的低功率LED管代替昂貴的激光管。而且，該熒光團壽命比CY5更長(cháng)(360 ns對1÷3ns)，我們再次建議光源使用LED (壽命比激光器更長(cháng))。最后，在系統集成方面，信號控制電路設計可能變得更簡(jiǎn)單。

有很多問(wèn)題能影響集成光電檢測系統的實(shí)現，為發(fā)現所有的問(wèn)題，本文設定一個(gè)雙重探討目標：將熒光團作為溶液參數(鹽水與染料溶液的濃度)加以研究;探討硅光電倍增管在測量生物樣本熒光過(guò)程中的性能表現。

II. 實(shí)驗儀器工具

A.待測產(chǎn)品描述

本文中的被測硅光電倍增管是意法半導體卡塔尼亞(意大利)研發(fā)中心研制的多片光電檢測解決方案[2]。該多片方案共有7個(gè)光電檢測器，其中像素數量從1個(gè)到400個(gè)。具體地說(shuō)，單像素檢測器(圖1g)1個(gè)，而25像素(圖1：a和 d)、100像素(圖1：b和 e)和400像素(圖1：c和 f)點(diǎn)陣式檢測器各有兩個(gè)，(按尺寸劃分)分為有光溝槽和無(wú)光溝槽兩類(lèi)[8]。為了對所選器件施加偏壓，采集輸出信號，多片光電倍增管被焊接到一個(gè)敞開(kāi)的32引腳封裝內。

圖1：多片光電倍增管結構圖，其中a、b、c和d、e、f分別代表 5×5、 10×10、20×20像素有溝槽和無(wú)溝槽光電檢測器;g是單像素光電檢測器。

B.樣品制備

將CY5 (取自iCycler iQ Calibrator Dye Solution Set #170-8792, Bio-rad) 和 100μg/ml Ru(bpy)32+置于三種不同的溶濟中: H2O milliQ、PBS (磷酸鹽緩沖鹽水) 0.1 M和 PBS 0.01 M。 CY5被稀釋成30%和40%兩種濃度。PBS是一種用NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4制成的鹽水溶液。若需要，加適量稀鹽酸(HCl)或氫氧化鈉(NaOH)，將pH值調到7.2。PBS用于測試鹽的存在對染料熒光的影響，我們發(fā)現，在黑暗條件下，取每種溶液2 μl，置于玻片(選擇玻片的原因是其厚度為0.13-0.16 mm)上，形成直徑幾毫米的液滴。將玻片樣品置于干燥器內，風(fēng)干30分鐘(30’)。

C.測量?jì)x器

我們用下面圖2所示的儀器工具測定樣品發(fā)射的熒光信號。激光二極管(相干立方體激光器) 負責發(fā)射光線(xiàn)，PC機控制發(fā)射光。發(fā)射光在撞擊樣本前，被濾波器衰減30 dB。我們使用兩個(gè)660 nm 或403 nm波長(cháng)的激光二極管分別激發(fā)CY5和Ru(bpy)32+。測定照射樣品的激光的功率，該功率是電激光二極管功率的一個(gè)函數。當電激光功率在10-80 mW 時(shí)，照射樣品的激光的功率在11-113 μW之間。

圖2：測量?jì)x器工具

硅光電倍增管設為連續工作模式，并連至Keithley 236源測量?jì)x，將硅光電倍增管置于角度計上，以便讓操作人員能夠觀(guān)察不同發(fā)射角的熒光信號。樣本置于激光二極管的同一光軸上，光線(xiàn)正常照射樣本表面。將硅光電倍增管用作光子計數器，使用脈沖工作模式檢測非常微弱的熒光信號。用安捷倫脈沖發(fā)生器Agilent 81110A驅動(dòng)激光二極管取得的脈沖激光波形(周期10ms，波長(cháng)4 ns)測量CY5樣本發(fā)射的光子。在這種情況下，同樣讓激光正常照射置于同一光軸上的樣本，將硅光電倍增管與激光二極管置于同一平面上，且與激光管光軸的夾角為60°，用硅光電倍增管檢測樣本發(fā)射的熒光。該指定角度可確保被檢測到的光噪聲 (玻片反射的激光) 最低。向硅光電倍增管施加-30V或 -32V偏壓。若需要更高的信號強度，則施加更高的偏壓。用示波儀(Tektronix DPO7104)記錄檢測到的信號，通過(guò)專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)的Labview軟件采集信號，在PC機上使用Matlab軟件對信號進(jìn)行后分析。

III.測試結果與分析討論

A.器件定性分析

該多片方案內的光電檢測器全都具有光電特性[9]。我們的目標是確定最佳的信噪比[10]，測量了該器件的反向電流-電壓 (I-V)特性和暗計數數量(DC)，即在無(wú)光照條件下由被檢測到的熱生成載波引發(fā)的雪崩(計數)。圖3a所示是5×5 (綠線(xiàn))、10×10 (藍線(xiàn))、20×20 (紅線(xiàn))像素點(diǎn)陣有溝槽光電檢測器在室溫條件下的典型反向I-V特性。圖3b所示是暗計數測量結果，暗計數測量就是對硅光電倍增管施加-30V偏壓，然后通過(guò)歸一化計算取得的像素數量。通過(guò)直接比較不同陣列，我們發(fā)現兩個(gè)明顯的主要特性：所有測試條件中擊穿電壓(BV)相同，如果像素數量增加，則器件噪聲(暗電流和暗計數)隨之提高[8]。BV (-28V)和 -35 V區間是Geiger模式工作的目標范圍。在這個(gè)區間，暗電流隨著(zhù)像素數量增加而線(xiàn)性提高，這種現象在圖3b第一個(gè)區間 (0.5 #p.e.)更為明顯 。

圖3 (a) 25像素 (綠線(xiàn))、100像素 (藍線(xiàn))、400像素 (紅線(xiàn))有溝槽硅光電倍增管的反向 I-V特性; (b) 25像素 (綠線(xiàn))、100像素 (藍線(xiàn))、400像素 (紅線(xiàn))有溝槽硅光電倍增管的暗計數特性

當只有一個(gè)單元計數時(shí)，所有器件的暗計數相同，這證明反向電流的上升呈線(xiàn)性。在圖3b的第2區間(1.5 #p.e.)，硅光電倍增管的三個(gè)器件呈現不同的特性，兩個(gè)像素光電檢測器同失效，5×5像素有光溝槽器件是硅光電倍增管中暗計數最少的光電檢測器，這表示其串擾概率最低，因此信噪比最高。這個(gè)結果讓我們將25像素光電檢測器定義為最符合我們目標的器件。

B.樣品定性分析

為研究熒光特性和生物傳感器性能，我們采取了多種測量方法(見(jiàn)實(shí)驗)。圖4描述了在室溫時(shí)兩個(gè)熒光染料在20°-90°位置的熒光特性。值得一提的是，圖中電流值是熒光信號電流減去參考樣品(玻片)電流測量值的凈電流。圖4還描述了兩種不同濃度的CY5溶液(圖4a)和Ru(bpy)32+ (圖 4b)的熒光特性。硅光電倍增管偏壓為-30V，激光功率為72μW。在測試分析中，出現了一些值得注意的結果：CY5濃度增加導致熒光電流測量值增加，信號值在兩種熒光團的滿(mǎn)量程內基本上是常數，證明熒光信號的各向同性發(fā)射特性[11]; milliQ水溶液是確保熒光凈電流(圖中沒(méi)有顯示)最大的最佳溶液。若想解釋Ru(bpy)32+是熒光團溶液濃度的函數，還需要進(jìn)一步研究探索。最后，我們用H2O milliQ水溶液制成濃度30%的CY5溶液，然后用硅光電倍增管的光子計數工作模式，測量該樣品發(fā)射的光子數量。這個(gè)測量過(guò)程分為兩個(gè)步驟：在硅光電倍增管上施加-32V偏壓，分析參考樣品(頂部無(wú)CY5沉淀物)和 CY5樣品。在第一種情況中，示波器采集的信號是硅光電倍增管的固有噪聲和玻片反射的激光輻射產(chǎn)生的殘余噪聲(在這種工作條件下非常低)。然后，我們將CY5沉淀樣品置于激光二極管的同一光軸上，在示波器屏幕上，進(jìn)入連續模式，可以看到不同振幅的信號，因為平均4個(gè)像素被光子射中。圖5詳細描述了捕獲的數據。具體地說(shuō)，藍實(shí)線(xiàn)表示發(fā)射光子的分布，而紅實(shí)線(xiàn)則表示從參考樣品捕獲的噪聲。多達6個(gè)光子照射傳感器工作區，在光電頻譜中測量到的熒光峰值間隔代表一個(gè)像素提供的電量。硅光電倍增管增益(G) 為輸出電荷Qto與被檢測到的光子nph和電子電荷(q)的比值:

G=Qtot/nph·q ---------- (1)

假設平均一個(gè)光子引發(fā)一個(gè)像素雪崩，則增益的表達式如下：

G=Qpixel/q= CD ·(VBIAS - VBD) /q ---------- (2)

由于在-32V偏壓下，CD 通常是在 10 – 100 fF范圍內，所以，假設nph=1，VBD = -28V，單個(gè)光電頻譜內的峰值間隔測量值大約是3.50·10-13，對應的增益值為2.2·106。不過(guò)，當硅光電增管偏壓上升時(shí)，記錄的增益和噪聲測量值都會(huì )提高，為確保最佳的信噪比，我們必須找到一個(gè)折衷的解決方案。因為CY5吸收波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng)十分拉近(分別為650 nm和670 nm)，所以集成化檢測器難以實(shí)現。熒光壽命短暫(1÷3ns)需要實(shí)現更加復雜的控制和管理電路。另一方面，可以選用一個(gè)不同的熒光染料，例如，Ru(bpy)32+,因為吸收和發(fā)射峰值之間的巨大差距(分別為450 nm和630 nmy)和長(cháng)壽命(大約360 ns)，該新型染料讓人們能夠降低對光學(xué)和電子器件的工作條件的要求。

32+ (綠線(xiàn))溶液在20°- 90°位置的熒光特性 >

圖4(a) 30% CY5溶液(藍線(xiàn))和40% CY5溶液(紅線(xiàn)) 在20°- 90°位置的熒光特性; (b) 700μg/ml Ru(bpy)32+ (綠線(xiàn))溶液在20°- 90°位置的熒光特性

圖5：CY5熒光光子計數分布(藍線(xiàn))，噪聲(紅線(xiàn))

IV.結論

在本文中，意法半導體卡塔尼亞研發(fā)中心研制的硅光電倍增管可檢測生物樣本發(fā)射的弱熒光，用于研制易用的生化光學(xué)系統。此外，我們優(yōu)化的生物傳感器方案可讓設備廠(chǎng)商研制非常緊湊的便攜光電系統。

通過(guò)多片產(chǎn)品定性分析，我們確定5×5像素有光溝槽的光電檢測器的暗計數和串擾概率最低，最適合我們的應用要求。脈沖式測量方法的結果證明，硅光電倍增管可用作光子計數器，還用于生物感測設備。硅光電倍增管和u(bpy)32+ 創(chuàng )新染料的特性讓我們能夠最大限度縮減器件尺寸，為片上實(shí)驗室應用創(chuàng )造機會(huì )。