諾獎得主Ardem Patapoutian丨Piezo1的發(fā)現用了一年，開(kāi)發(fā)更高通量系統，尋找更多機械敏感蛋白

Patapoutian 發(fā)現的 Piezo1 和 Piezo2 離子通道在觸覺(jué)、運動(dòng)感知、血壓、呼吸和膀胱控制等生理過(guò)程中起重要作用。
而除了離子通道之外，Patapoutian 還發(fā)現了另一類(lèi)壓力傳感器， G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 中一種叫做 GPR68 的蛋白，在小直徑（阻力）動(dòng)脈的內皮細胞中表達，可作為剪切應力傳感器，是心血管病理生理學(xué)中的關(guān)鍵信號組件。
這篇題為 “GPR68 senses flow and is essential for vascular physiology” 的文章于 2019 年發(fā)表在 Cell 上。高通量篩選出 GPR68 基因

在發(fā)現 Piezo1 的實(shí)驗中，該團隊進(jìn)行了功能基因組小干擾 RNA (siRNA) 篩選，使用薄膜壓痕和電生理記錄，這是一個(gè)低通量篩選，該團隊用了近一年時(shí)間，在篩選了 72 個(gè)候選基因后，才最終確定了 Piezo1 基因。
為了加速與機械轉導相關(guān)的基因組篩選，團隊重新設計了一種新型的 384 孔高通量 (HT) 機械刺激系統，并使用已經(jīng)發(fā)現的 Piezo1 基因驗證了該系統的準確性和可行性。

研究人員通過(guò)初篩，選擇了對剪切力變化最敏感的乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 進(jìn)行實(shí)驗，將該細胞的 Piezo1 和 Piezo2 基因敲低，發(fā)現并不影響細胞的剪切應力響應，說(shuō)明該細胞還存在其它分子負責傳感剪應力。
于是研究人員針對編碼具有兩個(gè)或多個(gè)預測跨膜結構域的蛋白質(zhì)基因構建了 siRNA 文庫，該文庫包含 21,925 個(gè)獨特的 siRNA，靶向由 2,765 個(gè)獨特基因編碼的 3,175 個(gè)獨特參考序列。

最終研究人員確定了 GPR68 基因，該基因敲低會(huì )導致細胞對剪切應力響應程度下降。GPR68 被描述為質(zhì)子激活的 GPCR，實(shí)驗結果也表明 MDA-MB-231 細胞在 pH 值 7.4-6.9 時(shí)（正常動(dòng)脈血 pH 值約為 7.4，6.9 代表嚴重酸中毒）對剪切應力響應最敏感，表明 GPR68 確實(shí)需要質(zhì)子的存在才能感知剪切應力。
研究還發(fā)現，GPR68 與其他已知的機械敏感性 GPCR 不同，在同等條件刺激下，僅有 GPR68 能產(chǎn)生響應，其它受體均無(wú)任何反應，說(shuō)明了 GPR68 對剪切應力的獨特敏感性。

在模擬血液層流測試中，GPR68 也能夠對壓力刺激產(chǎn)生響應，而其它與層流傳感器有關(guān)的蛋白質(zhì)則無(wú)響應。GPR68 的血管生理作用

研究確定了 Gpr68 優(yōu)先在小直徑阻力動(dòng)脈中表達，小直徑阻力動(dòng)脈是調節血流阻力的主要部位，表明 Gpr68 可能在血流介導的血管舒張中發(fā)揮作用。
為了測試這一點(diǎn)，研人員從純合 Gpr68-eGFP 小鼠的大腦中分離出小鼠原代微血管內皮細胞 (MVEC)，并測定它們對流動(dòng)室中剪切應力的反應。隨著(zhù)壓強逐漸增加，表達 Gpr68 的內皮細胞通過(guò)增加細胞內鈣水平對流動(dòng)作出反應，降低其基因表達水平后，反應消失。這些結果表明 MVEC 細胞中的內源性 Gpr68 是剪切應力響應所必需的。

然后研究人員從 Gpr68 基因敲除鼠中分離了腸系膜動(dòng)脈 (MA) 并進(jìn)行了體外插管實(shí)驗，使用去氧腎上腺素刺激血管收縮，發(fā)現其 3 階（研究將腸系膜動(dòng)脈由主支到分支，由粗到細分為 1、2、3 階）血管的收縮程度顯著(zhù)低于正常小鼠，1、2 階血管沒(méi)有明顯差別。
研究人員繼續使用了一種名為 Ogerin 的 GPR68 變構調節劑（可以特異性調節人和小鼠 GPR68 的活性）刺激血管，如預想一樣，Ogerin 可以刺激正常小鼠 3 階血管的劑量依賴(lài)性擴張，但 Gpr68 基因敲除鼠的血管在 1 nM 到 1 μM 的 Ogerin 濃度范圍內沒(méi)有擴張反應。
上述結果說(shuō)明，Gpr68 基因是體外小鼠小直徑腸系膜動(dòng)脈的流動(dòng)介導的擴張反應所必需的。
研究人員還證明了在血管缺血情況下，GPR68 可促進(jìn)旁支血管直徑增大，介導血流量增加引起的血管外向重塑 ，同樣這一作用也只限定于小直徑動(dòng)脈。
綜上所述，研究人員證明了 GPR68 是小動(dòng)脈內皮中必不可少的流量傳感器。
文章最后指出，高通量剪切應力刺激系統極大地提高了機械轉導分析的通量，這種使能技術(shù)使得對新型機械敏感蛋白和通路進(jìn)行無(wú)偏見(jiàn)的全基因組篩選成為可能。新型機械傳感器 GPR68 的鑒定驗證了這一創(chuàng )新系統的價(jià)值和潛力，并擴展了在體內感知機械力的膜蛋白庫。

參考資料：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5951615/
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