高效液相色譜法測定龍葵中的澳洲茄胺

　　目的建立龍葵中澳洲茄胺的高效液相色譜（HPLC）檢測方法。方法采用甲醇酸水超聲提取龍葵生物堿，在回流條件下對生物堿苷進(jìn)行酸性水解，得到相應的澳洲茄胺。然后進(jìn)行高效液相色譜檢測，色譜條件：色譜柱為DiamonsilC18色譜柱（250mm×4.6mm），乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）體系為流動(dòng)相，流速為1.0ml/min，檢測波長(cháng)為210nm。結果龍葵生物堿獲得了良好的基線(xiàn)分離；澳洲茄胺的線(xiàn)性范圍為102～612μg·ml-1（r=0.9999）；加樣回收率超過(guò)96.0%，RSD為3.35%（n=6）。結論該方法簡(jiǎn)單快速，準確可靠，可作為龍葵藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法。該方法也為龍葵質(zhì)量標準的制定及進(jìn)一步的藥效學(xué)研究提供了可靠的數據和方法學(xué)平臺。

　　龍葵SolanumnigrumL.為茄科（Solanaceace）植物龍葵一年生草本植物，別名野葡萄、老鴉眼睛草、苦菜、苦葵［1］。龍葵全草均可入藥，其生物活性成分主要包括甾體類(lèi)生物堿、多糖、維生素A和維生素C等。其中，甾體類(lèi)生物堿具有抗腫瘤活性，龍葵也因此被列為十大抗腫瘤中草藥之一［2～5］。

　　龍葵生物堿主要以生物堿苷的形式存在［5］，由于苷元與生物堿苷存在對應關(guān)系，因此以苷元來(lái)定量龍葵生物堿是常用的分析手段。澳洲茄堿（solasonine）和澳洲茄邊堿（solamargine）是龍葵的主要活性成分，它們水解后的苷元是澳洲茄胺（solasodine）（見(jiàn)圖1）。文獻常采用測定澳洲茄胺來(lái)定量龍葵生物堿，包括重量法、電位滴定法、比色法和薄層掃描法［6］。但是，這些方法操作繁瑣，準確度差。近年來(lái)，高效液相色譜憑借其優(yōu)異的分離分析能力已成為中藥這一復雜體系的強有力的分析工具。最近，蔣新宇等［7］基于澳洲茄胺的分析，提出了一種龍葵中甾體類(lèi)生物總堿的高效液相色譜檢測方法。但該方法側重于龍葵生物堿的提取、水解過(guò)程，其高效液相色譜檢測過(guò)程仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。本研究通過(guò)對提取分離各環(huán)節的實(shí)驗優(yōu)化和嚴格的方法學(xué)驗證，提出了一種簡(jiǎn)單可靠的澳洲茄胺的高效液相色譜定量方法。

　　1器材與方法1.1儀器與試劑Agilent1100Series高效液相色譜儀；電子天平（MettlerAE240，德國）；KQ318T型超聲清洗器（昆山市超聲波儀器公司）；高速粉碎機（FW-100型，北京市永光明醫療器械廠(chǎng)）；pHS-3C酸度計（上海雷磁分析儀器公司）。

　　澳洲茄胺（Solasodine）對照品購自Sigma-alderich公司（圣路易斯，美國）；流動(dòng)相用的甲醇和乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純。全程使用二次蒸餾水。

　　龍葵藥材全草購自南昌匯仁堂藥店。龍葵果實(shí)由江西樟樹(shù)某藥材經(jīng)銷(xiāo)商友情提供，經(jīng)常規植物分類(lèi)學(xué)方法鑒定為茄科（Solanaceace）植物龍葵的果實(shí)。

　　1.2色譜條件DiamonsilC18色譜柱（250mm×4.6mm）。流動(dòng)相為乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）；流速1.0ml/min；檢測波長(cháng)210nm；進(jìn)樣量20μl。

　　1.3溶液的制備1.3.1對照品溶液精密稱(chēng)取對照品適量，加甲醇溶解，所得澳洲茄胺的濃度為1.02mg/ml。

　　1.3.2樣品溶液精密稱(chēng)取龍葵藥材2g，加甲醇20ml，1.0M鹽酸10ml，超聲提取40min，收集上清液，濾過(guò)。向濾液中續加6M鹽酸5ml，回流水解1h。趁熱揮去回流液中的甲醇，以氨水調pH值至10，繼以醋酸乙酯萃取兩次。分取醋酸乙酯層，揮干溶劑，殘渣以適量甲醇溶解，轉入10ml容量瓶，以甲醇稀釋至刻度，分析前以0.45μm濾膜濾過(guò)。對龍葵果實(shí)的樣品溶液，在進(jìn)樣前稀釋10倍。以澳洲茄堿水解為澳洲茄胺為例，水解反應示意圖見(jiàn)圖1。

　　2結果2.1提取方法的選擇文獻多采用回流法提取龍葵生物堿，該方法繁瑣費時(shí)。近年來(lái)，超聲提取法已被廣泛應用于中藥活性成分的提取。本實(shí)驗對這兩種提取方法做了系統比較，發(fā)現超聲提取簡(jiǎn)單快速，且能達到相同的提取效率。此外，對龍葵生物堿的水解條件諸如溶液pH，甲醇含量，水解時(shí)間等進(jìn)行了考察，獲得了上述優(yōu)化條件（見(jiàn)“1.3溶液的制備”項）。

　　2.2色譜條件的確定澳洲茄胺分子缺少共軛雙鍵結構，紫外吸收較弱，對其進(jìn)行紫外檢測時(shí)只能要么進(jìn)行衍生，要么選擇其末端吸收。當采用末端吸收波長(cháng)進(jìn)行檢測時(shí)，色譜流動(dòng)相最好采用截止波長(cháng)低的乙腈。但是，龍葵生物堿的色譜保留不強，如果采用洗脫強度大的流動(dòng)相，勢必影響分離。同樣，由于采用末端吸收進(jìn)行檢測，也不利于梯度洗脫，否則基線(xiàn)漂移嚴重。在大量實(shí)驗的基礎上，我們優(yōu)選了“1.2”項所述的色譜檢測條件。如圖2所示，在該條件下，澳洲茄胺在真實(shí)樣品中獲得了良好的基線(xiàn)分離。

　　2.3方法學(xué)驗證2.3.1標準曲線(xiàn)精密吸取澳洲茄胺儲備溶液0.5，0.8，1.0，2.0，2.5ml和3.0ml各置于5ml的容量瓶配成標準系列，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，在102～612μg/ml范圍內，對樣品濃度（X）與峰面積（Y）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y=689.52X 3.65，r=0.9999。

　　2.3.2精密度實(shí)驗取上述供試品溶液20μl，在上述色譜條件連續進(jìn)樣6次測定，澳洲茄胺峰面積的RSD為1.45%，符合含量測定要求。

　　2.3.3回收率實(shí)驗精密稱(chēng)取龍葵藥材6份，分為3組，依次按本底含量的50%，100%和150%加入澳洲茄胺對照品，按照供試品制備與測定方法，計算回收率。澳洲茄胺的平均回收率為96.0%，RSD=3.35%（n=6）。

　　2.4樣品測定按照“1.3”項條件制備龍葵樣品溶液，依“1.2”項條件進(jìn)樣分析，圖2-b是龍葵全草的典型色譜圖。按照外標法所得龍葵全草和成熟果實(shí)中的澳洲茄胺含量如表1。結果顯示，澳洲茄胺在龍葵果實(shí)中的含量明顯高于其在全草中的含量。

　　3結論澳洲茄堿與澳洲茄邊堿是龍葵藥材中的主要抗腫瘤活性成分。它們主要以澳洲茄胺為苷元的生物堿苷的形式存在于龍葵中，其含量在龍葵果實(shí)中最高，全草次之。由于澳洲茄堿和澳洲茄邊堿與澳洲茄胺存在著(zhù)一一對應的化學(xué)計量比關(guān)系，因此，以澳洲茄胺作為龍葵生物堿含量的評判指標是可行而且可靠的。本文所開(kāi)發(fā)的方法簡(jiǎn)單快速，準確可靠，可作為龍葵藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法。