轉基因食品的檢測方法

　　1996年德國伯恩斯坦大學(xué)的MeyerRolf等論證了PCR檢測轉基因食品的可能性，植物細胞轉入的基因成分一般包括啟動(dòng)子（promotor）、報告基因（reportergene）、目的基因（targetgene）和終止子（terminator），其中啟動(dòng)子和終止子為表達目的基因所必需。目前，轉基因植物所采用的啟動(dòng)子主要為來(lái)源于花椰菜花葉病毒的Camv35s啟動(dòng)子、根瘤農桿菌的nos啟動(dòng)子及玄參花葉病毒的FMV35s啟動(dòng)子；廣泛應用的終止子分別來(lái)源于根瘤農桿菌的nos終止子、花椰菜花葉病毒的camv終止子以及新霉素磷酸轉移酶NptII終止子。針對這些基因的PCR擴增可涵蓋95%的現有的轉基因植物的需要。

　　PCR定性檢測是高靈敏度的DNA水平檢測，但常伴有各種假性結果出現：（1）DNA提取時(shí)產(chǎn)生的各種反應抑制因子，使PCR呈假陰性；（2）產(chǎn)品深加工時(shí)核酸被破壞成碎片，含量極低，使PCR呈假陰性；（3）當作物受到花椰菜花葉病毒的感染而帶有35S啟動(dòng)子或因農桿菌感染而帶有nos終止子時(shí)，PCR呈假陽(yáng)性；（4）實(shí)驗室的殘留污染使檢測結果呈假陽(yáng)性；（5）在收獲、運輸或加工過(guò)程中轉基因食品與非轉基因食品產(chǎn)生交叉污染也會(huì )使檢測結果不準確。

　　要防止檢測出現假陰性結果，必須在檢測過(guò)程中嚴格遵守操作規程，優(yōu)化PCR條件，在DNA提取過(guò)程中盡量去除可能抑制PCR反應的物質(zhì)，并可通過(guò)擴增真核生物的18SrRNA基因來(lái)消除假陰性；要消除轉基因食品檢測中假陽(yáng)性結果的影響，可采用southern雜交、PCR產(chǎn)物純化測序或PCR擴增產(chǎn)物酶切分析等方法，對樣品同時(shí)檢測其Camv35s和nos基因雙元件，可避免某些作物因自然感染花椰菜花葉病毒或根癌農桿菌產(chǎn)生的假陽(yáng)性結果。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

　　實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，是指在常規PCR基礎上添加了一條標記了兩個(gè)熒光基團的探針，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量的方法。目前我們應用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測體系中的熒光探針主要有3種：分子信標探針，TaqMan探針和雜交雙探針。

　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測的靈敏度至少是競爭PCR的10倍，它可以檢測到每克樣品中含2pg轉基因的DNA量。對加工、未加工和混合樣品都可以進(jìn)行檢測。

　　實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有效地解決了傳統定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，可對整個(gè)PCR進(jìn)程的實(shí)時(shí)監測。此外，實(shí)時(shí)熒光PCR采用閉管分析，無(wú)需電泳等PCR后處理步驟，能有效消除核酸的交叉污染。由于在PCR反應體系中加入熒光探針，使得非特異性產(chǎn)物不能與探針雜交，尤其對與特異性產(chǎn)物分子量接近、通過(guò)電泳無(wú)法分開(kāi)的產(chǎn)物更為有效。當前此方法的挑戰就是定量標準物的滯后發(fā)展，商業(yè)化的標準物已不能滿(mǎn)足日漸增長(cháng)的轉基因檢測需要。Moreano等以轉基因油菜籽為檢測目標發(fā)展出了一種新型標準物的合成方法，從而為提高熒光定量檢測的標準化程度指明了方向。

　　基因芯片檢測法

　　當今應用于轉基因食品檢測的前沿技術(shù)當屬基因芯片技術(shù)，其實(shí)質(zhì)就是高度集成化的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)。探針?lè )肿庸潭ㄔ谳d體上，待測基因經(jīng)過(guò)PCR、末端標記等操作，成為標記有熒光染料或同位素的核酸分子，然后與固定的探針雜交。依據標記方法的不同，通過(guò)放射自顯影、激光共聚焦顯微鏡或CCD相機讀出每個(gè)斑點(diǎn)信號的強度，計算機對雜交信號進(jìn)行處理，得到雜交譜。該技術(shù)是20世紀90年代由美國的Affymetrix公司首先發(fā)展起來(lái)的，該公司曾在1996年制造出世界上第一塊商品化基因芯片。

　　免疫學(xué)和PCR檢測技術(shù)大部分情況下一次實(shí)驗只能檢測1種目標分子，在少數情況下能同時(shí)檢測2～3種目標分子?；蛐酒芙鉀Q大數量基因檢測問(wèn)題，具有靈敏度高、效率高、成本低、自動(dòng)化、結果明確等優(yōu)點(diǎn)。但由于其應用需要的相應設備造價(jià)高，普及范圍窄，而且目前沒(méi)有形成任何標準，使得基因芯片檢測法應用范圍不廣。

　　多重連接依賴(lài)的探針擴增（MLPA）

　　此方法是轉基因多重定量檢測的最新進(jìn)展，最初是由荷蘭的Dr．SchoutenJP于2002年發(fā)表的應用于醫學(xué)檢測目的高度靈敏的相對定量技術(shù)。它是利用簡(jiǎn)單的雜交、連接、PCR擴增反應，于單一反應管內同時(shí)檢測最多40個(gè)不同的核苷酸序列的拷貝數變化。

　　MLPA方法是針對不同檢測序列設計多組專(zhuān)一的探針組，對探針組進(jìn)行擴增的檢測方法。每組探針組總長(cháng)度不同，可與目標序列雜交黏合。所有探針的5′端都有通用引物結合區PBS（primerbindingsites），3′端都有與待擴增目標序列結合區，在PBS區與目標序列結合區之間插入不同長(cháng)度的寡核苷酸，由此形成長(cháng)度不一的探針組。如果目標序列缺失、產(chǎn)生突變或是由于不同探針組的配對，則這組探針無(wú)法成功連接，也沒(méi)有相應的擴增反應。如果這組探針可與目標序列完全黏合，則連接酶會(huì )將這組探針連接成為一個(gè)片段，并通過(guò)標記的通用引物對此連接在一起的探針組進(jìn)行擴增。最終經(jīng)過(guò)毛細管電泳和激光誘導的熒光來(lái)檢測擴增產(chǎn)物。

　　FranciscoMoreano等應用此方法檢測了標準的轉基因大豆和玉米并經(jīng)過(guò)特異性和敏感性實(shí)驗驗證了MLPA在轉基因檢測中的可行性。實(shí)驗表明，當探針與目標序列結合的片段長(cháng)度越長(cháng)，檢測的敏感性就增加，并且根據轉基因序列擴增強度與內參基因擴增強度的比值和轉基因含量之間的線(xiàn)性關(guān)系，可以對待檢樣品進(jìn)行定量分析。