高效液相色譜儀的原理

　　當達平衡時(shí)：KXY = ［X+Y-］有機相/［ X+］水相

　?。踄-］水相根據定義，分配系數為：

　　DX= ［X+Y-］有機相/［ X+］水相= KXY ［Y-］水相

離子對色譜法（特別是反相）解決了以往難以分離的混合物的分離問(wèn)題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。

　　5 ．離子色譜法（Ion Chromatography）

　　用離子交換樹(shù)脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動(dòng)相中強電解質(zhì)背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。

　　以陰離子交換樹(shù)脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過(guò)程）：

　　抑制柱上發(fā)生的反應：

　　R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

　　R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

　　可見(jiàn)，通過(guò)抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。

　　離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽(yáng)離子分析。

　　6 ．空間排阻色譜法（Steric Exclusion Chromatography）

　　空間排阻色譜法以凝膠 （gel）為固定相。它類(lèi)似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過(guò)。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過(guò)柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現。

　　高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統、輸液系統、．分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。

1．進(jìn)樣系統

　　一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

　　2．輸液系統

　　該系統包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。

　　3.分離系統

　　該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(cháng)度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由“優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構成）．固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹(shù)脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000？）和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(cháng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。

　　因此，這類(lèi)固定相對結構不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。

　　另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì )提高分辨率的道理。

再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。