激光掃描共聚焦顯微鏡系統及其在細胞生物學(xué)中的應用

　　摘 要 激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來(lái)的醫學(xué)圖象分析儀器，現已廣泛應用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細胞動(dòng)力學(xué)參數監測和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學(xué)顯微鏡質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個(gè)補充。本文以美國Meridian公司的ACAS ULTIMA312為例簡(jiǎn)要介紹了激光掃描共聚顯微鏡系統的結構，功能和生物學(xué)應用前景。

　　關(guān)鍵詞 激光；共聚焦顯微鏡；粘附細胞分析與篩選（ACAS）

　　激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning Confocal Microscopy ，簡(jiǎn)稱(chēng)LSCM）是近代生物醫學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，利用計算機進(jìn)行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀(guān)察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。已廣泛應用于細胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域[1、2、3]，對生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強有力的研究工具。

　　創(chuàng )建于1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項具有劃時(shí)代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國“政府新產(chǎn)品獎”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎”，它能達到每秒120幅畫(huà)面的高速掃描激光共聚焦觀(guān)察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類(lèi)儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器?，F以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統及其在細胞生物學(xué)中的應用。

　　1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成

　　有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長(cháng)通分色反射鏡使光束偏轉90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì )聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、長(cháng)通分色反射鏡、聚焦透鏡、會(huì )聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔，由檢測器接收。

　　從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達檢測器，其它位置發(fā)出的光均不能過(guò)針孔。由于物鏡和會(huì )聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上，因而稱(chēng)這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過(guò)程中針孔起著(zhù)關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學(xué)顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和分辨率有重要的影響。

　　ACAS ULTIMa 312采用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點(diǎn)掃描成像，由于樣品中不同的掃描點(diǎn)始終在物鏡和會(huì )聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個(gè)樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當激光逐點(diǎn)掃描樣品時(shí)，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應光點(diǎn)的共聚焦圖像，并將之轉化為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚聚焦圖像。一個(gè)微動(dòng)步進(jìn)馬達控制栽物臺的升降，使焦平面依次位于標本的不同層面上，可以逐層獲得標本相應的光學(xué)橫斷面的圖像。這稱(chēng)為“光學(xué)切片”。再利用計算機的圖像處理及三維重建軟件?？梢缘玫礁咔逦葋?lái)表現標本的外形剖面，十分靈活、直觀(guān)地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。

　　2、激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統

　　2.1 ACAS ULTIMa 312硬件及參數指標　　激光光源：氬離子激光（50mW的紫外光、999 mW的可見(jiàn)光），能同時(shí)/順序/分別輸出紫外光和可見(jiàn)光，激發(fā)波長(cháng)為351-364nm；488nm；514nm?！　∮嬎銠C系統：80586/133MHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬盤(pán)/150MB Bernoulli盤(pán)驅動(dòng)器/17’’大屏幕顯示器?！　」簿劢瓜到y：計算機自動(dòng)控制光路準調節；計算機控制孔徑校準；計算機調節孔徑大??；自動(dòng)Z軸調節（最小0.1μm）?！　」鈱W(xué)探測系統：3個(gè)測窗式PMT采集熒光；1個(gè)CCD系統；12位的高速A/D轉換器?！　D像分辨率：圖像大小1535×1535；像素最小距離：0.1μm；灰度為4096級?！　呙璺绞剑嚎焖夔R掃描Dual Scan臺階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積最大為10cm×8cm ；掃描平面：XY和XZ和獨特點(diǎn)、線(xiàn)、面掃描。2.2激光掃描共聚焦顯微鏡軟件系統

　　ACAS ULTIMa 312系統采用獨特設計的軟件將激光細胞儀與先進(jìn)的計算機技術(shù)結合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統，完備的數據采集、分析與管理功能?；谏镝t學(xué)研究有如下的軟件。

　　Image Analyze―對于單色、比色和三色標記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時(shí)Auto Image可多個(gè)區域的自動(dòng)掃描和熒光定量，以及相同區域的時(shí)間順序掃描?！　atio Analysis和 Kinetics―測定細胞內的離子變化，可有點(diǎn)掃描、線(xiàn)掃描及圖像掃描三種測定形式，以監測各種速率的生物反應?！　ell ?CCell Communication and FRAP-相鄰細胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細胞熒光，然后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)掃描，此掃描可對單一區域或細胞的多個(gè)選擇區域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊?！　ell List―儲存被選擇細胞的位置，即可自動(dòng)對較大樣品進(jìn)行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡(luò )位置表，以進(jìn)行自動(dòng)的測量、篩選和重復測定?！　ell Sorting―ACAS具備如下四種分選方式：　　Ablation Sort:預選定義一個(gè)熒光閾值 ，然后對特定細胞殺傷。②CookieCutter Sort在用戶(hù)定義的中心點(diǎn)四周切割Cookies。③Quick Sort：對已定義的細胞表列，用Ablation或Cookie Cutter作分選。④Manual Sort：直接使用鼠標控制載物臺位置及激光脈沖，并殺滅和分選細胞，進(jìn)行細胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作?！　onfocal Imaging―共聚焦分析，可實(shí)現Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點(diǎn)移動(dòng)動(dòng)畫(huà)。

　　3 激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞生物學(xué)中的應用

　　3.1 定量熒光測量

　　ACAS可進(jìn)行重復性極佳的低光探測及活細胞熒光定量分析。利用這一功能既可對單個(gè)細胞或細胞群的溶酶體，線(xiàn)粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結合等生化反應程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準確監測抗原表達，細胞結合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達的準確定位及定量信息。

　　3.2 定量共聚焦圖像分析

　　借助于A(yíng)CAS 激光共焦系統，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細胞結構的空間關(guān)系。能測定細胞光學(xué)切片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴散、胞內離子等，亦可以對這些動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行準確的定性、定量、定時(shí)及定位分析。

　　3.3 三維重組分析生物結構

　　ACAS使用SFP進(jìn)行三維圖像重組，SFP將各光學(xué)切片的數據組合成一個(gè)真實(shí)的三維圖像，并可從任意角度觀(guān)察，也可以借助改變照明角度來(lái)突出其特征，產(chǎn)生更生動(dòng)逼真的三維效果。

　　3.4 動(dòng)態(tài)熒光測定

　　Ca2+ 、pH 及其它細胞內離子測定，利用ACAS能迅速對樣品的點(diǎn)，線(xiàn)或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多種熒光探針對各種離子作定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U散速率，能定量測定細胞溶液中Ca2+對腫瘤啟動(dòng)因子、生長(cháng)因子及各種激素等刺激的反應，以及使用雙熒光探針Fluo-3和CNARF進(jìn)行Ca2+和pH的同時(shí)測定。

　　3.5 熒光光漂白恢復（FRAP）--活細胞的動(dòng)力學(xué)參數

　　熒光光漂白恢復技術(shù)借助高強度脈沖式激光照射細胞某一區域，從而造成該區域熒光分子的光淬滅，該區域周?chē)姆谴銣鐭晒夥肿訉⒁砸欢ㄋ俾氏蚴苷諈^域擴散，可通過(guò)低強度激光掃描探測此擴散速率。通過(guò)ACAS可直接測量分子擴散率、恢復速度，并由此而揭示細胞結構及相關(guān)的機制。

　　3.6 胞間通訊研究

　　動(dòng)物細胞中由縫隙連接介導的胞間通訊被認為在細胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于測定相鄰植物和動(dòng)物細胞之間細胞間通訊，測量由細胞縫隙連接介導的分子轉移，研究腫瘤啟動(dòng)因子和生長(cháng)因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用，以及胞內Ca2+ ,PH和cAMP水平對縫隙連接的調節作用。

　　3.7 細胞膜流動(dòng)性測定

　　ACAS設計了專(zhuān)用的軟件用于對細胞膜流動(dòng)性進(jìn)行定量和定性分析。熒光膜探針受到極化光線(xiàn)激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴(lài)于熒光分子的旋轉，而這種有序的運動(dòng)自由度依賴(lài)于熒光分子周?chē)哪ち鲃?dòng)性，因此極性測量間接反映細胞膜流動(dòng)性。這種膜流動(dòng)性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點(diǎn)，溫度反應測定和物種比較等方面有重要作用。

　　3.8 籠鎖―解籠鎖測定

　　許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時(shí)，其功能被封閉，而一旦被特異波長(cháng)的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復原有活性和功能，在細胞的增值、分化等生物代謝過(guò)程中發(fā)揮功能。利用ACAS可以人為控制這種瞬間光的照射波長(cháng)和時(shí)間，從而達到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時(shí)間和空間作用。

　　3.9 粘附細胞分選

　　ACAS是目前唯一能對粘附細胞進(jìn)行分離篩選的分析細胞學(xué)儀器，它對培養皿底的粘附細胞有兩種分選方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司專(zhuān)利技術(shù)，首先將細胞貼壁培養在特制培養皿上，然后用高能量激光的欲選細胞四周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細胞則因在八角形之外而被去除，該分選方式特別適用于選擇數量較少諸如突變細胞、轉移細胞和雜交瘤細胞，即使百萬(wàn)分之一機率的也非常理想。（2）激光消除法，該方法亦基于細胞形態(tài)及熒光特性，用高能量激光自動(dòng)殺滅不需要的細胞，留下完整活細胞亞群繼續培養，此方法特別適于對數量較多細胞的選擇。

　　3.10 細胞激光顯微外科及光陷阱技術(shù)

　　借助ACAS可將激光當作“光子刀”使用，借此來(lái)完成諸如細胞膜瞬間穿孔、切除線(xiàn)粒體、溶酶體等細胞器、染色體切割、神經(jīng)元突起切除等一系列細胞外科手術(shù)。通過(guò)ACAS光陷阱操作來(lái)移動(dòng)細胞的微小顆粒和結構，該新技術(shù)廣泛用于染色體、細胞器及細胞骨架的移動(dòng)。

　　4、結語(yǔ)

　　激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來(lái)的醫學(xué)圖像分析儀器，與傳統的光學(xué)顯微鏡相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三維清晰度的原色圖象。并可探測某些低對比度或弱熒光樣品，通過(guò)目鏡直接觀(guān)察各種生物樣品的弱自發(fā)熒光。能動(dòng)態(tài)測量Ca2+ 、pH值，Na1+、Mg2+等影響細胞代謝的各種生理指標[9]，對細胞動(dòng)力學(xué)研究有著(zhù)重要的意義。同時(shí)激光掃描共聚顯微鏡可以處理活的標本，不會(huì )對標本造成物理化學(xué)特性的破壞，更接近細胞生活狀態(tài)參數測定?？梢?jiàn)激光掃描共聚焦顯微鏡是普遍顯微鏡上的質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個(gè)補充，現已廣泛用于熒光定量測量，共焦圖像分析，三維圖像重建、活細胞動(dòng)力學(xué)參數分析和胞間通訊研究等方面，在整個(gè)細胞生物學(xué)研究領(lǐng)域有著(zhù)廣闊的應用前景。