離心技術(shù)的應用

離心技術(shù)的應用

離心技術(shù)（centrifugal technique）是根據顆粒在作勻速圓周運動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的行為而發(fā)展起來(lái)的一種分離技術(shù)。這項技術(shù)應用很廣，諸如分離出化學(xué)反應后的沉淀物，天然的生物大分子、無(wú)機物、有機物，在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來(lái)收集細胞、細胞器及生物大分子物質(zhì)。

　　一、基本原理的分類(lèi)

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　?、彪x心力（centrifugal force，Fc）離心作用是根據在一定角度速度下作圓周運動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω²X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

　　其中ω是旋轉角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開(kāi)旋轉中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。

　?、蚕鄬﹄x心力（relative centrifugal force，RCF）由于各種離心機轉子的半徑或者離心管至旋轉軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。

　　RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉化為重力加速度的倍數。

　　式中X為離心轉子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec²）；n為轉子每分鐘的轉數（rpm）。

　　在上式的基礎上，Dole和Cotzias制作了與轉子速度和半徑相對應的離心力的轉換列線(xiàn)圖，見(jiàn)圖16-4，在用圖16-4將離心機轉數換成相對離心力時(shí)，先在離心機半徑標尺上取已知的離心機半徑和在轉數標尺上取已知的離心機轉數，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線(xiàn)，在圖中間RCF標尺上的交叉點(diǎn)，即為相應的離心力數值。例已知離心機轉數為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來(lái)交于RCF標尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

　?、吵两迪禂担╯edimentation coefficient，s）根據1924年Svedberg對沉降系數下的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。

　　若ω用2πn/60表示，則

　　式中X₁為離心前粒子離旋轉軸的距離；X₂為離心后粒子離旋轉軸的距離。S實(shí)際上時(shí)常在10^-13秒左右，故把沉降系數10^-13秒稱(chēng)為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，量綱為秒。

　?、闯两邓俣龋╯edimentation velocity）沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時(shí)間內物質(zhì)運動(dòng)的距離。

　　式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρ_P為粒子的密度；ρ_m為介質(zhì)的密度。

　　從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數公式中，則S的表示式也可表示為：

　　從該式中可看出，①當ρ_P＞ρ_m，則S＞0，粒子順著(zhù)離心方向沉降。②當ρ_P＝ρ_m，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρ_P＜ρ_m，則S＜0，粒子逆著(zhù)離心方向上浮。

　?、党两禃r(shí)間（sedimentation time，Ts）在實(shí)際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來(lái)的問(wèn)題，這就必須首先知道用多大轉速與多長(cháng)時(shí)間可達到目的。如果轉速已知，則需解決沉降時(shí)間來(lái)確定分離某粒子所需的時(shí)間。

　　根據沉降系數（S）式可得：

圖16-4　離心力的轉換列線(xiàn)圖

　　將左側r點(diǎn)與右側n點(diǎn)連成一條直線(xiàn)，與中間RCF相交的

　　點(diǎn)即為相對離心力(×g)RCF=1.118×10²×r×n²。

　　積分得

　　式中X₂為離心轉軸中心至離心管底內壁的距離；X₁為離心轉軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內壁的時(shí)間（t₂－t₁）用Ts表示則式可改為：

　　式中Ts以小時(shí)為單位，S以Svedberg為單位。

　?、禟系數（k factor） K系數是用來(lái)描述在一個(gè)轉子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。也就是溶液恢復成澄清程度的一個(gè)指數，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

　　其中R_max為轉子最大半徑；R_min為轉子最小半徑。由其公式可知，K系數與離心轉速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數是一個(gè)變數。當轉速廢，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時(shí)，K系數就改變了。通常，離心機的轉子說(shuō)明書(shū)中提供的K系數，都是根據最大路徑及在最大轉速下所計算出來(lái)的數值。如果已知粒子的沉降系數為80S的Polysome，采用的轉子的K系數是323，那么預計沉降到管底所需的離心時(shí)間是T＝k/S＝4h，利用此公式預估的離心時(shí)間，對水平式轉子最適合；對固定角式轉子而言，實(shí)際時(shí)間將比預估的時(shí)間來(lái)得快些。

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　　根據離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設計出許多離心方法，綜合起來(lái)大致可分三類(lèi)。

　?、逼胶怆x心法根據粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differential velocity centrifugation）和速率區帶離心法（rate zonal centrifugation）。

　?、驳让芏入x心法（jsopycnic centrifugation）又稱(chēng)等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區帶離心法合稱(chēng)為密度梯度離心法。

　?、辰?jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構象變化等。

　　二、離心分離方法

　?。ㄒ唬┎钏匐x心法

　　它利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對離心力，使一個(gè)非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過(guò)程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。

　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數在同一個(gè)數量級內的各種粒子不容易分開(kāi)，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

　　例如用差速離心法分離已破碎的細胞各組份

　?。ǘ┧俾蕝^帶離心法

　　速率區帶離心法是在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂