人類(lèi)大腦紡錘形神經(jīng)元轉錄圖譜獲解析 激光顯微切割技術(shù)功不可沒(méi)

　　中科院昆明動(dòng)物研究所日前宣布，該所宿兵研究組與中南民族大學(xué)中國人類(lèi)腦庫中心開(kāi)展合作，利用激光顯微切割和微量樣本RNA測序技術(shù)，解析了來(lái)源于人腦前扣帶回紡錘形神經(jīng)元的轉錄圖譜。該項目得到中科院先導專(zhuān)項和國家自然科學(xué)基金委重點(diǎn)項目的資助，相關(guān)成果已發(fā)表于國際知名神經(jīng)生物學(xué)刊物《Cerebral Cortex》上。

　　項目介紹

　　研究表明，舊大陸猴、猿類(lèi)和人類(lèi)等靈長(cháng)類(lèi)大腦進(jìn)化出一類(lèi)新的神經(jīng)細胞，稱(chēng)為紡錘形神經(jīng)元(VEN)，人類(lèi)大腦中的VEN數量是最多，但在新大陸猴等更原始的靈長(cháng)類(lèi)中則沒(méi)有這類(lèi)神經(jīng)元存在。神經(jīng)生物學(xué)家猜測VEN可能參與人類(lèi)社會(huì )認知能力等的高級認知功能，但由于VEN在大腦中分布的局限(僅集中分布于前腦島和前扣帶回兩個(gè)腦區)以及技術(shù)上的局限性，人們對VEN的確切功能幾乎一無(wú)所知。因此，構建該類(lèi)細胞的轉錄圖譜是了解細胞功能的一個(gè)重要基礎性工作。

　　宿兵研究組利用激光顯微切割和微量樣本RNA測序技術(shù)，發(fā)現了300多個(gè)VEN特異表達升高或降低的基因，并鑒定了4個(gè)新的VEN標記基因。對轉錄組數據的進(jìn)一步分析發(fā)現，這些基因與VEN的形態(tài)發(fā)育(如樹(shù)突分支和髓鞘化等)和功能(如人類(lèi)社會(huì )情感類(lèi)疾病等)都密切相關(guān)。人類(lèi)VEN轉錄圖譜的解析，為了解這類(lèi)在靈長(cháng)類(lèi)大腦進(jìn)化和人類(lèi)大腦起源中扮演重要角色的神經(jīng)元提供了重要的基礎數據，也為研究人類(lèi)神經(jīng)精神疾病(如自閉癥等)的發(fā)病機制提供了重要信息。

　　在這項研究中，激光顯微切割技術(shù)對分離細胞、提取RNA起到了重要作用。

　　激光顯微切割技術(shù)發(fā)展歷程

　　顯微切割技術(shù)是90年代初發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，它能夠從組織切片或細胞涂片上的任一區域內切割下幾百個(gè)、幾十個(gè)同類(lèi)細胞，甚至是單個(gè)細胞，再進(jìn)行后續相關(guān)的分子生物學(xué)方面的研究如PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)組學(xué)和其他分析技術(shù)。顯微切割的發(fā)展經(jīng)歷了手動(dòng)直接顯微切割、機械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光顯微切割4個(gè)階段。

激光顯微切割平臺

　　1996年，美國國立衛生院國家腫瘤研究所的首次開(kāi)發(fā)出基于近紅外激光熔膜原理的激光捕獲顯微切割技術(shù)，用于動(dòng)物細胞的切割和DNA、RNA分析。次年，美國Arcturus Engineering公司成功研制激光捕獲顯微切割系統，并實(shí)現商品化銷(xiāo)售。又過(guò)了5年之后，激光捕獲顯微切割才在植物研究中成功應用，此后這一技術(shù)在生物研究中迅速發(fā)展并被廣泛應用。激光顯微切割技術(shù)可將顯微鏡下觀(guān)察到的目標細胞直接用激光取出，與早期技術(shù)相比，這種技術(shù)有著(zhù)快速、簡(jiǎn)單、精確、特異性強、準確度高、細胞形態(tài)保持完好、細胞內分子結構保持完整等優(yōu)點(diǎn)。

　　激光顯微切割原理

　　目前激光顯微切割從激光類(lèi)型和技術(shù)原理上可分為兩種，分別是基于近紅外激光(810nm波長(cháng))的LCM (激光捕獲顯微切割)和基于紫外激光(337～355nm波長(cháng))的LMD(激光顯微切割)兩種。前文所提的紡錘形神經(jīng)元轉錄圖譜項目，采用的就是LCM技術(shù)。

　　LCM 系統包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載物臺(固定載玻片)的操縱桿、電耦合相機及彩色顯示器。用于捕獲目標細胞的熱塑膜(乙烯乙酸乙烯酯，EVA)直徑通常為6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰與后繼實(shí)驗所用的標準 0.5ml離心管相匹配。

　　LCM技術(shù)的原理是在組織切片上方懸著(zhù)機械臂控制的收集管，收集管的塑料帽表面有一層的熱塑膜(其最大吸收峰接近紅外激光波長(cháng))，在顯微鏡下選擇好目標細胞后，發(fā)射低能紅外激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜融化與目標細胞黏合再迅速凝固。接著(zhù)目標細胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并隨著(zhù)塑料帽一起移走。

　　機械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脫水組織切片上的目標部位。顯微鏡直視下選擇目標細胞，發(fā)射激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，并在幾毫秒內與目標細胞黏合并迅速凝固。激光脈沖通常持續0.5～5.0毫秒，并且可在整個(gè)塑料帽表面進(jìn)行多次重復，當組織與膜的粘合力超過(guò)了其與載玻片間的粘合力，就可以迅速分離大量的目標細胞。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，分離的細胞就轉移至離心管中，從而可以分析出目標細胞的分子生物學(xué)特征，用于進(jìn)行后續研究。

　　EVA膜約100～200μm厚，能夠吸收激光產(chǎn)生的絕大部分能量，在瞬間將激光束照射區域的溫度提高到90°C，保持數毫秒后又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。采用低能量紅外激光的同時(shí)也可避免損傷性光化學(xué)反應的發(fā)生。

　　LCM的優(yōu)點(diǎn)在于快速、簡(jiǎn)單、精確、無(wú)污染，而且適用任何玻片類(lèi)型，尤其是采用能量較低的近紅外光，不直接接觸樣品，激光發(fā)出的大部分能量都被熱塑膜吸收，對樣品影響較小。

　　而LMD技術(shù)則需要將標本切片裝片在薄膜載玻片或者薄膜覆蓋的玻璃載玻片上。脈沖紫外激光(UV-A)通過(guò)物鏡聚焦在切片上，沿著(zhù)目標區域的邊緣移動(dòng)切割，使選擇區域內的細胞脫離下來(lái)且周?chē)M織完好。由于紫外激光的波長(cháng)和生物組織的吸收峰非常接近，故常用于切割較厚的樣品組織。

　　激光顯微切割技術(shù)應用現狀

　　目前，激光顯微切割技術(shù)較以往的顯微切割技術(shù)有了突破性的進(jìn)展，現已廣泛應用于神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究、植物分析、法醫學(xué)或氣候研究等領(lǐng)域。該方法同時(shí)也適用于細胞培養的操作或蓋玻片的顯微雕刻。盡管應用日趨廣泛，但也有一些問(wèn)題亟待解決，例如設備成本、進(jìn)行組織切片時(shí)需要通過(guò)固定和染色才能進(jìn)行細胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察，可能會(huì )影響細胞的狀態(tài)以及RNA、蛋白質(zhì)的變化等。

　　目前市場(chǎng)上主要有四家公司提供激光顯微切割的平臺，分別是美國賽默飛世爾、德國徠卡、德國蔡司和瑞士MMI，而推出世界上第一臺商用激光捕獲顯微切割系統的Arcturus則于2010年被賽默飛世爾收購。賽默飛世爾的旗艦產(chǎn)品ArcturusXT是唯一將基于紅外的LCM和基于紫外的LMD激光切割融為一體的顯微切割儀器，而蔡司、徠卡和MMI都只能使用紫外激光對目標細胞進(jìn)行切割和收集。

　　ArcturusXT激光捕獲顯微切割系統有著(zhù)開(kāi)放的平臺，能夠升級并擴展應用以滿(mǎn)足不斷變化的研究需求。例如其開(kāi)放的顯微鏡接口能讓用戶(hù)修改系統，可增加高分辨率的照相機以獲得更精確的影像。開(kāi)放的系統設計還實(shí)現了載物臺插板的輕松互換，可容納不同的樣本形式，如神經(jīng)生物學(xué)研究所用的更大玻片。

　　徠卡提供LMD6500和LMD7000激光顯微切割系統，利用紫外激光分離顯微鏡頭之下的目標區域，并通過(guò)重力這種溫和的方法來(lái)收集樣品。在徠卡的兩款系統中，均使用高精度的光學(xué)組件來(lái)控制激光束移動(dòng)。光束焦點(diǎn)有自動(dòng)修正功能，可在全自動(dòng)模式和交互模式中切換，同時(shí)顯微鏡樣品臺和樣品本身保持不動(dòng)。通過(guò)這種專(zhuān)利方法，可以達到超乎想象的精度。

　　瑞士MMI公司主推CellEctor Plus單細胞分選系統和CellCut Plus激光顯微切割系統，利用固態(tài)紫外激光對組織切片等樣本中的目標細胞進(jìn)行切割和收集。在整個(gè)分離過(guò)程中，激光都不與需要分離的樣本接觸，對樣本損傷小，從而保證了樣本RNA的完整性。此系統在樣本收集時(shí)采用PTP(Predefined Target Positioning)技術(shù)，將黏性管蓋劃分成若干區域，對組織切片中同種類(lèi)型細胞進(jìn)行黏附收集，提高樣品的收集效率，節省成本;通過(guò)計量統計可保證下游的核酸、蛋白實(shí)驗有足夠的樣本量。

　　蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束來(lái)切割和分離樣本，不過(guò)它收集樣本的方式比較特別。通過(guò)一種激光誘導的壓力波將細胞彈入管中。MicroBeam的彈射力就好像在您的樣品下方發(fā)生光誘導的微型爆炸，隨之而來(lái)的沖擊波向上推動(dòng)組織。對于較大的區域，MicroBeam也可以使用粘性管蓋。