清華學(xué)者主導干濕結合“下一代細胞工廠(chǎng)”開(kāi)源使能平臺問(wèn)世！數據驅動(dòng)全基因組基因型-工業(yè)表型關(guān)聯(lián)技術(shù)，賦能合成生物學(xué)高效底盤(pán)細胞設計

1976 年 1 月的一天，一位年輕的風(fēng)險投資人和一位微生物學(xué)教授走進(jìn)了加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）附近的酒吧，原定十分鐘的會(huì )面時(shí)間延長(cháng)到了三個(gè)小時(shí)。從那一刻起，一家改變生物技術(shù)史的公司就此誕生。他們使用 GENetic ENgineering TECHnology 的縮寫(xiě)命名了這家公司——Gen-en-tech（基因泰克）。

圖丨Genentech 的聯(lián)合創(chuàng )始人赫伯特·博耶（Herbert Boyer）博士（左）和風(fēng)險投資人羅伯特·斯萬(wàn)森（Robert A.Swanson）先生（右）（來(lái)源：資料圖）

Genentech 公司首次成功地將人胰島素的 DNA 重組到大腸桿菌細胞內的質(zhì)粒上，讓大腸桿菌作為細胞工廠(chǎng)生產(chǎn)出重組人胰島素，并將其產(chǎn)品化。從此，正式拉開(kāi)了基因工程的序幕。

然而，四十多年過(guò)去了，人們在技術(shù)層面上重組表達胰島素，幾乎只做了一件事——把外源的 DNA 放進(jìn)細胞，讓這個(gè)基因轉錄成 RNA，翻譯成蛋白質(zhì)，然后再?lài)@著(zhù)該外源 DNA 的表達翻譯效率做些工程化改造。

蛋白要在宿主細胞中高效表達，其實(shí)不僅是信息傳遞。原料供應、肽鏈延長(cháng)、翻譯后修飾，折疊、分泌乃至應急修復等，諸多環(huán)節都有可能影響到蛋白表達的效率。

“要讓細胞這臺精巧的蛋白質(zhì)‘3D 打印機’高效率運轉，在全基因組層面有大量的基因發(fā)揮著(zhù)不可或缺作用。然而，盡管我們在基礎研究的層面認識到這件事，但是，到工程層面上，還很難做到全基因組層面的工程化以提升細胞的蛋白表達效率，我們目前的認識還很淺?！鼻迦A大學(xué)張翀教授表示。

張翀是清華大學(xué)長(cháng)聘副教授，國家級青年人才計劃獲得者，主要研究方向為微生物智能制造，開(kāi)展高通量基因型-表型關(guān)聯(lián)原創(chuàng )技術(shù)與裝備的研究，包括微生物工業(yè)表型高通量表征與連續進(jìn)化，全基因組規?；蚣拔稽c(diǎn)功能挖掘，基因型與工業(yè)表型關(guān)聯(lián)研究裝備等。

圖丨張翀（來(lái)源：張翀）

迄今為止，細胞工廠(chǎng)已能夠生產(chǎn)抗生素、氨基酸、重組蛋白、生物能源、生物塑料乃至“人造肉”，被廣泛地應用在生物制造、制****、食品、能源和農業(yè)等領(lǐng)域。

但是，與重組胰島素合成的案例一樣，目前人們對外源途徑改造較多，但對全基因組層面底盤(pán)細胞本身了解較少，進(jìn)而制約了對其系統化工程改造的能力，細胞底盤(pán)自身的潛能還沒(méi)有被系統地挖掘。

如果把外源途徑的基因序列比作圖紙，把細胞比作車(chē)間，那么，現有的努力大多是在“圖紙”上下功夫，但是仍然十分缺乏對“車(chē)間”全局的系統認知和工程化改造的能力。

 從隨機誘變到全基因組定制，多項技術(shù)催生底盤(pán)細胞“發(fā)現新大陸”

合成生物學(xué)細胞工廠(chǎng)構建的核心是如何通過(guò)設計合適的基因型，從而得到人們想要的工業(yè)表型。張翀教授認為，在基因組時(shí)代，科學(xué)家可通過(guò)各類(lèi)公開(kāi)生物學(xué)數據庫得到大量的基因型相關(guān)的測試數據，但是，真正有價(jià)值的是能得到與工業(yè)表型關(guān)聯(lián)的基因型數據。

圖丨合成生物學(xué)常關(guān)注的工業(yè)表型（來(lái)源：該團隊）

隨著(zhù)分子生物學(xué)和基因工程研究方法的不斷發(fā)展，細胞工廠(chǎng)的構建策略經(jīng)歷了不同的歷史階段。相較于早期主要通過(guò)非理性誘變育種技術(shù)獲得目標產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的方式，20 世紀 90 年代以來(lái)，隨著(zhù)分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的逐步引入，代謝工程學(xué)科正式創(chuàng )立。

代謝工程利用重組 DNA 技術(shù)對生物體中已知的代謝途徑進(jìn)行有目的的設計，并對細胞內的基因網(wǎng)絡(luò )進(jìn)行調控和優(yōu)化，構建具有特定功能的細胞工廠(chǎng)，例如提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。

然而，代謝工程指導的設計方法大多都基于已知的生物學(xué)知識，由于微生物代謝網(wǎng)絡(luò )中存在諸多可能對目標產(chǎn)物工業(yè)表型產(chǎn)生影響的未知因素，或稱(chēng)為“生命暗物質(zhì)”。這一手段獲取新知識的效率不高，細胞工廠(chǎng)改造過(guò)程仍然需要耗費大量的時(shí)間和精力。

圖丨細胞工廠(chǎng)設計和構建發(fā)展歷程與展望 （來(lái)源：該團隊）

那么，為了讓讓細胞工廠(chǎng)的設計更高效，如何去解析這些“生命暗物質(zhì)”呢？

“通過(guò)自有的技術(shù)平臺從全基因組層次并行研究微生物特定工業(yè)表型與基因型的關(guān)系，從而獲得大規模的基因型-工業(yè)表型關(guān)聯(lián)（genotype phenotype associations，GPA）數據集?！睆埩埍硎?。

“近年來(lái)，高通量 DNA 合成成本的降低、基因編輯技術(shù)和二代測序技術(shù)的飛躍、高通量檢測技術(shù)的成熟等多項技術(shù)的發(fā)展讓大規模的 GPA 數據集的挖掘成為可能。這些新挖掘的數據將成為基因組層面的‘新大陸’?！彼f(shuō)。

“新大陸”指的是新發(fā)現的跟目的工業(yè)表型相關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)，例如他們發(fā)現很多意外的、和蛋白質(zhì)合成有關(guān)系的位點(diǎn)，比如氧化應激（Oxidative Stress）對蛋白質(zhì)合成有積極的幫助等。

“基于全基因組規模關(guān)聯(lián)圖譜獲取新知識并驗證其工業(yè)價(jià)值后，再在底盤(pán)上進(jìn)行系統工程改造，將為系統提升細胞工廠(chǎng)效率提供一條‘發(fā)現-工程’相結合的全新路徑。”張翀說(shuō)。

通過(guò)超高通量、快速、低成本的技術(shù)“三部曲”、實(shí)現全基因組規?；蛐?工業(yè)表型關(guān)聯(lián)位點(diǎn)挖掘

張翀團隊已經(jīng)成熟打造了一套技術(shù)平臺，通過(guò)該平臺，可進(jìn)行超高通量、快速、低成本地對全基因組規模進(jìn)行 GPA 數據集的挖掘。

該平臺的背后有三個(gè)核心技術(shù)的支撐，分別為：CRISPR 全基因組編輯技術(shù)、超高通量液滴微流控單克隆培養篩選一體化技術(shù)和合成生物傳感技術(shù)。

圖丨全基因組規模 CRISPR 基因干擾文庫（來(lái)源：該團隊）

第一，CRISPR 全基因組編輯技術(shù)。該團隊針對典型的工業(yè)宿主建立了細胞全基因組規?？蛇_百萬(wàn)量級 CRISPR 基因干擾文庫。這里的“干擾”，指的是把底盤(pán)細胞的基因敲低或激活，甚至進(jìn)行基因編輯[1,2,3]。

張翀表示，在該平臺通過(guò) CRISPR 編輯技術(shù)實(shí)現了“高版本”的基因型突變。這里的“高版本”是因其具備可定制、可追蹤兩大特點(diǎn)。也就是說(shuō)，科學(xué)家可在任意位點(diǎn)設計 sgRNA 的干擾或編輯，并且，在表型變化后，不用測全基因組即可追蹤 sgRNA 的具體位置。

據悉，目前該團隊已有多種成熟工業(yè)底盤(pán)細胞全基因組編輯細胞文庫，并獨立開(kāi)發(fā)了全基因組 sgRNA 文庫設計軟件與 web 應用程序。

圖丨全基因組 sRNA 文庫設計軟件工具開(kāi)發(fā)流程（來(lái)源：該團隊）

第二，自主研發(fā)具有百萬(wàn)通量級篩選能力的液滴微流控細胞培養及篩選一體化技術(shù)。張翀團隊結合微流控技術(shù)和光電傳感與控制及自動(dòng)化技術(shù)開(kāi)發(fā)的“微生物微液滴培養技術(shù) ”，可實(shí)現皮升、納升、微升級多種體積規模下的微生物液滴平行培養、生長(cháng)曲線(xiàn)測定和適應性進(jìn)化。

該平臺采用集成式單克隆培養，單次單克隆數量可超 106 個(gè)，與傳統方法相比，培養成本降低約 1000 倍 。并且，該平臺可自動(dòng)換液，細胞生長(cháng)狀態(tài)高度均一 ，適宜多種成熟工業(yè)微生物生長(cháng)[4]。

張翀指出，通過(guò)環(huán)境條件的控制，液滴內微生物可能實(shí)現“工業(yè)相似性”培養?！斑@相當于實(shí)現了文庫獨立的基因型轉變?yōu)楠毩⒌姆磻?，讓它生長(cháng)出可獲取的目標表型?！?/span>

圖丨超高通量液滴微流控單克隆培養篩選一體化平臺（來(lái)源：該團隊）

第三，自主研發(fā)的高靈敏、毫秒級響應合成生物傳感器。通常，對百萬(wàn)個(gè)皮升級液滴的表型進(jìn)行測試，會(huì )采用定向的光學(xué)技術(shù)，尤其是熒光技術(shù)。為此，該團隊建立了一系列針對蛋白質(zhì)、小分子濃度定量測試的合成生物熒光傳感技術(shù)[5,6,7]。

通過(guò)該技術(shù)，可將目標分子濃度定量地轉化成熒光信號，其靈敏度高、響應速度快，與百萬(wàn)量級通量的液滴微流控系統完全兼容，為目的代謝物表型-基因型關(guān)聯(lián)圖譜的繪制奠定基礎。

 圖丨蛋白產(chǎn)量與折疊生物傳感器模型（來(lái)源：該團隊） 

干濕結合的中心化實(shí)驗室，整合數據孤島，打造國內首個(gè)合成生物學(xué)數據開(kāi)源使能平臺

目前，生物科學(xué)領(lǐng)域所使用的數據庫，例如 NCBI、KEGG、PDB 等，都是靠科學(xué)家團隊供應離散式數據集成形成的，其主要還是科學(xué)屬性的數據庫?！?strong style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">設想如果我們手頭擁有海量工業(yè)需求驅動(dòng)的 GPA 數據庫，這樣就掌握著(zhù)設計高效細胞工廠(chǎng)的核心原始數據。”張翀說(shuō)。

他指出，從行業(yè)內部來(lái)看，合成生物學(xué)雖然潛力巨大，但是技術(shù)發(fā)展得很早期，還有很多問(wèn)題需要解決。合成生物學(xué)是個(gè)兼具科學(xué)屬性與工程屬性的交叉學(xué)科，但是現階段，科學(xué)屬性仍然較重，工程化較弱。尤其是學(xué)術(shù)界，很多研發(fā)的方式還停留在“手工作坊”階段。

張翀認為，通過(guò)自動(dòng)化和高通量技術(shù)讓科學(xué)家做實(shí)驗的過(guò)程變成中心平臺化的形式，以此來(lái)促進(jìn)合成生物學(xué)從科學(xué)屬性向工程屬性轉移。一旦把這個(gè)鏈條打通，未來(lái)合成生物學(xué)就變成了純粹的信息科學(xué)和數據科學(xué)的問(wèn)題。

從生物制造領(lǐng)域來(lái)看，細胞工廠(chǎng)設計是未來(lái)的發(fā)展趨勢，從現在離散式的個(gè)人實(shí)驗室變成中心化實(shí)驗室平臺，從分布式的數據向集成的大規模數據生產(chǎn)，這種高度標準化、高質(zhì)量的數據為最后演變?yōu)锳I驅動(dòng)的設計提供了極大的可能性。

如果能夠利用大規模 GPA 數據集，基于數據科學(xué)手段從全基因組范圍深度挖掘傳統分子生物學(xué)手段無(wú)法發(fā)現的未知關(guān)聯(lián)基因及其位點(diǎn)，將有可能從數據學(xué)習的角度繞開(kāi)理性設計的知識瓶頸，為提高細胞工廠(chǎng)設計和創(chuàng )建效率提供全新的研究范式。

此外，由于大規模 GPA 數據集搜索范圍更寬（全基因組），不依賴(lài)于現有知識，將有可能探索之前理性/半理性所無(wú)法達到的表型“高地”，獲得生產(chǎn)效率更為高效、生產(chǎn)性能更加優(yōu)越的下一代定制化細胞工廠(chǎng)。

對于該平臺，張翀團隊對其規劃不僅限于對科學(xué)家的單點(diǎn)服務(wù)，還計劃逐漸實(shí)行學(xué)術(shù)端開(kāi)源，助力多維度合成生物學(xué)的數據標準化。以高通量基因型-工業(yè)表型關(guān)聯(lián)圖譜數據驅動(dòng) AI 解析細胞工廠(chǎng)，打造合成生物數據使能平臺。

該平臺用工程手段推進(jìn)科學(xué)研究升級，將輔助科學(xué)家實(shí)現技術(shù)轉化，并銜接行業(yè)上下游。當平臺發(fā)展到一定程度，便會(huì )積累較高的產(chǎn)業(yè)化勢能，將來(lái)會(huì )有多種產(chǎn)業(yè)化的可能性。

“科學(xué)家通過(guò)提需求，確認想要做的菌株以及表型后，我們來(lái)幫他做實(shí)驗，再將結果反饋給科學(xué)家。同時(shí)，我們希望把數據沉淀到平臺，同時(shí)開(kāi)放地讓學(xué)術(shù)貢獻共同獲取，并驗證它的應用價(jià)值。未來(lái)，這會(huì )成為若干工業(yè)表型圖設計的核心驅動(dòng)力?！睆埩堈f(shuō)。

據悉，該團隊已與國內重點(diǎn)高校相關(guān)實(shí)驗室建立廣泛合作，如清華大學(xué)、天津大學(xué)、華東理工大學(xué)、上海交通大學(xué)、江南大學(xué)、中科院上海植生所等。同時(shí)，張翀正在為該平臺進(jìn)行技術(shù)授權及產(chǎn)業(yè)化落地，目前已在籌備成立相關(guān)公司并組建技術(shù)研發(fā)團隊，張翀教授出任首席科學(xué)家。 

對該平臺的未來(lái)發(fā)展，張翀充滿(mǎn)期待，他稱(chēng)：“我相信擁有數據的核心資源，也就掌握了細胞工廠(chǎng)設計的核心信息，我們希望這類(lèi)關(guān)鍵數據庫生根在中國，并服務(wù)于中國本土的科研與產(chǎn)業(yè)?！?/span>

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