哈佛團隊開(kāi)發(fā)小分子化合物篩選新策略，可直接靶向非編碼RNA，專(zhuān)家解讀：成****還有很長(cháng)的路要走

一直以來(lái)，蛋白質(zhì)類(lèi)靶點(diǎn)在傳統小分子****物中占據著(zhù)絕對的領(lǐng)導地位，盡管人類(lèi)基因組中 98% 的 核苷酸序列產(chǎn)生的RNA 并不會(huì )翻譯為蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，即使整個(gè)蛋白質(zhì)組中僅有一小部分可以作為****物的靶標，RNA 也并未成為****物開(kāi)發(fā)選擇的主流靶標。業(yè)界普遍認為，以具有穩定形狀和構象的蛋白質(zhì)為依據開(kāi)發(fā)相應的****物更為安全、有效。

然而，隨著(zhù)越來(lái)越多的疾病被歸因于非編碼 RNA，以及科學(xué)界對 RNA 的研究不斷加強，以 RNA 作為靶點(diǎn)的可行性不斷被證實(shí)。近 10 年來(lái)，以 RNA 作為靶標進(jìn)行小分子****物開(kāi)發(fā)的****企也逐漸增多。

哈佛醫學(xué)院遺傳學(xué)教授 Jeannie Lee 表示，“非編碼 RNA 在基因組中發(fā)揮著(zhù)非常重要的作用，我們了解到，非編碼空間中的突變會(huì )導致疾病，而且非編碼 RNA 的數量可能遠遠多于蛋白質(zhì)編碼基因。如果有能夠靶向這些 RNA 的方式，將極大擴展我們可以找到治療患者****物的領(lǐng)域?！?/span>

不過(guò)，目前全球獲批上市的靶向 RNA 的小分子****物仍是屈指可數。其中， 2020 年 FDA 批準上市的脊髓性肌萎縮癥****物 evrysdi，為首個(gè)獲批上市的靶向 RNA 的小分子****物。

然而，“當前已經(jīng)證明可以靶向 RNA 的小分子****物如 evrysdi、linezolid、ribocil、branaplam 等都是通過(guò)表型篩選的手段發(fā)現，后續通過(guò)實(shí)驗證明是靶向 RNA。”ReviR（溪礫科技）聯(lián)合創(chuàng )始人、董事長(cháng)李陽(yáng)博士告訴生輝。

可以說(shuō)，對于加快靶向 RNA ****物的發(fā)現尚需一種可擴展的、直接發(fā)現靶向 RNA 的化合物分子篩選方法。對此，Jeannie Lee 團隊開(kāi)發(fā)了一種可直接篩選靶向非編碼 RNA 的小分子化合物的策略，并且他們使用該方法證明了篩選出的小分子化合物可與名為 Xist 的非編碼 RNA 結合。相關(guān)論文于近日發(fā)表在 Nature 上。

（來(lái)源：Nature）

“該研究的關(guān)鍵突破是找到并且證明了一種新的靶向 RNA 小分子化合物的篩選方法，而且，他們證明了這種小分子化合物是直接作用于 Xist 的，而非其所表達的蛋白。”新加坡國立大學(xué)醫學(xué)院助理教授史家海告訴生輝。

非編碼 RNA Xist 是一種使X染色體失活的關(guān)鍵分子，Xist 上富含 GC 序列的區域 RepA 主要負責基因沉默，RepA 異常導致X 染色體未失活將引發(fā)相應的遺傳疾病。

在 Jeannie Lee 團隊驗證其設計的篩選靶向 RNA 的小分子化合物方法中，以 Xist 為靶點(diǎn)展開(kāi)，并且為首個(gè)靶向Xist化合物的高通量篩選方案。

該團隊基于親和質(zhì)譜技術(shù)設計了一種無(wú)偏方法，使用已應用于蛋白質(zhì)篩選的 ALIS 系統進(jìn)行靶向 RNA 的小分子化合物篩選，這一系統可自動(dòng)識別親和力大于 10μM 的可逆性結合配體。

具體而言，該團隊利用這一方法在默克的包含 5 萬(wàn)種小分子化合物的文庫中進(jìn)行篩選，發(fā)現了 20 個(gè)表現出合理****物特性的化合物，有 15 個(gè)展現出了與配體較強的親和力。

其中，具有吲唑-苯并咪唑支架獨特構象的化合物 X1 為與配體結合親和力最強的一個(gè)，且對 RepA 具有高度的特異選擇性。

為進(jìn)一步驗證其篩選出的化合物 X1 對 RepA 功能的影響，該團隊將 X1 與促進(jìn) Xist 傳播、沉默 X 染色體的同源蛋白 RepA RNA、PRC2 以及 SPEN-RRM 的相互作用進(jìn)行了檢測。測試結果顯示，在 X1 的作用下，RepA 與同源蛋白之間的相互作用逐漸受到影響（下圖f）。并且，相互作用的希爾系數為 1.4-1.5，這表明 X1 在影響 RepA 功能過(guò)程中可能會(huì )發(fā)揮協(xié)同作用，即不止一個(gè) X1 分子與 RepA 結合。

（來(lái)源：Nature）

“這一研究表明，通過(guò)高通量手段直接篩選 RNA 結合的小分子已經(jīng)可以實(shí)現。”李陽(yáng)說(shuō)道。

對于這項研究發(fā)現，李陽(yáng)總結了兩個(gè)重要的意義：

第一，小分子靶向 RNA 被證明可行?！岸疫@次他們選擇的是非編碼 RNA 作為靶點(diǎn)來(lái)篩選化合物，預示著(zhù)非編碼 RNA 也能成為制****靶點(diǎn)來(lái)開(kāi)發(fā)****物，更加拓寬了 RNA 制****領(lǐng)域的范圍，將使得傳統認為不可靶向的靶點(diǎn)可以進(jìn)一步被挖掘?！崩铌?yáng)說(shuō)道。

就現階段而言，溪礫科技也已經(jīng)開(kāi)始針對 ncRNA 以及 mRNA 靶點(diǎn)進(jìn)行小分子****物篩選。

第二，表明了可以通過(guò)一些高通量手段來(lái)直接篩選 RNA 結合的小分子，其他的如 DNA 編碼化合物庫（DEL）也逐漸被應用。

對此，復旦大學(xué)生物醫學(xué)研究院于文強教授也表達了類(lèi)似的觀(guān)點(diǎn)。他表示這篇研究主要貢獻在于證明了小分子靶向 RNA 的可行性，“其采用一種小分子****物，來(lái)打開(kāi)或改變 RNA 的二級結構，換句話(huà)說(shuō)，RNA 序列雖然結合在位置上，但是后續因為小分子干預導致二級結構變化而沒(méi)有相關(guān)蛋白質(zhì)的結合，最終也發(fā)揮不了作用?！?/span>

（來(lái)源：Pixabay）

人類(lèi)基因組中的絕大多數 RNA 是非編碼的，非編碼 RNA 的不穩定性使得制****公司不愿意開(kāi)發(fā)靶向它的****物。于文強則認為，“并非因為非編碼 RNA 不穩定而不去開(kāi)發(fā)****物，非編碼 RNA 作為****物的靶點(diǎn)，其主要問(wèn)題是機制和下游靶點(diǎn)十分不明確，而且毒性太強，盡管該問(wèn)題目前已經(jīng)得到部分解決。”

據介紹，在制****領(lǐng)域，相較于以蛋白質(zhì)作為靶點(diǎn)進(jìn)行****物開(kāi)發(fā)，將 RNA 作為靶點(diǎn)存在一些不足，比如，RNA 結構相對蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單，需要解決靶點(diǎn)特異性問(wèn)題；而且小分子與 RNA 靶點(diǎn)結合較弱。

當然，將 RNA 作為靶點(diǎn)也有優(yōu)勢，比如蛋白層面不可成****靶點(diǎn)可以被靶向，同一個(gè)基因存在多個(gè)潛在 RNA 靶點(diǎn)，并且存在大量可成****機制可以被探索，如 ribotac。

關(guān)于****物靶點(diǎn)的選擇，李陽(yáng)指出，其與具體機制相關(guān)，一些可選的策略與蛋白靶點(diǎn)類(lèi)似，比如，選擇具有復雜結構或者高質(zhì)量結合口袋的 RNA motif；靶向 RNA-蛋白相互作用（branaplam、risdiplam）；調控 mRNA 可變剪切的 motif。

于文強認為，“RNA 存在兩個(gè)維度，一個(gè)是結構，一個(gè)是序列。不論是 RNA ****物還是蛋白質(zhì)****物，其靶點(diǎn)要么是針對結構、要么是針對序列?！贬槍@種蛋白質(zhì)結構設計的****物，有一些成功的案例。

“RNA 通過(guò)堿基互補配對，極容易受到環(huán)境的影響，導致結構極其不穩定，這也就意味著(zhù) RNA 的結構是高度動(dòng)態(tài)的，是很難預測的?！庇谖膹娬f(shuō)道，“RNA ****物應該是以 RNA 序列靶向為主的發(fā)展。”

“RNA ****物目前很少，原因在于 RNA ****物進(jìn)入體內會(huì )觸發(fā)免疫反應，雖然在實(shí)驗室的細胞環(huán)境中效果較好，但是一旦進(jìn)入臨床試驗便會(huì )出現免疫反應和毒副作用等?！彼a充說(shuō)。但隨著(zhù)mRNA疫苗的應用，其毒副作用問(wèn)題將不再是一個(gè)瓶頸問(wèn)題。

（來(lái)源：Pixabay）

但從這項研究發(fā)現到真正能夠實(shí)現將 RNA 作為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)****物，還有很長(cháng)的路要走。

在李陽(yáng)看來(lái)，具體還需要克服兩大難題：其一，尋找特異性的 RNA 靶點(diǎn)；其二，擴展靶向 RNA 特異性結構的小分子庫。“這項研究的命中率極低，我們需要更多知識來(lái)定義哪些小分子更可能靶向 RNA，目前我們知之甚少，但高通量測序/實(shí)驗+AI 是很有潛力的解決方案?！崩铌?yáng)說(shuō)道。

“我了解到的，其實(shí) RNA 靶向的小分子****物開(kāi)發(fā)已經(jīng)興起快 20 年了，最近 10 年非常熱門(mén)。想要將 RNA 作為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)****物，也需要重點(diǎn)解決脫靶效應。因為 RNA 和 RNA 之間非常類(lèi)似，而小分子所能覆蓋的長(cháng)度又不夠，所以很容易出現脫靶問(wèn)題?！笔芳液Ｖ赋?。