專(zhuān)訪(fǎng)蔡孟浩丨華東理工團隊歷時(shí)八年三次迭代改造畢赤酵母，開(kāi)發(fā)即插即用通用型平臺，有望產(chǎn)業(yè)化應用

生物制****和制造行業(yè)需要高水平和可控的基因表達來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。如何設計和開(kāi)發(fā)兼具高表達強度和靈活調控特性的新型表達系統，是生物工程和合成生物技術(shù)所面臨的關(guān)鍵問(wèn)題和重要目標之一。

酵母作為人們熟知的真核微生物，在食****方面的應用已有悠久的歷史，在現代蛋白生產(chǎn)和生物合成方面也有非常廣泛的應用。甲基營(yíng)養型酵母 —— 巴斯德畢赤酵母，因其生長(cháng)密度高、蛋白表達強、遺傳穩定好和糖基化修飾溫和等優(yōu)點(diǎn)，在學(xué)術(shù)研究和工業(yè)生產(chǎn)中均展現了很好的應用效果，已成為重組蛋白表達的優(yōu)選底盤(pán)細胞。
然而，畢赤酵母作為一種非模式生物體，其強啟動(dòng)子種類(lèi)和數量有限，且多基于甲醇誘導特性，在工業(yè)設施安全和食品應用安全方面存在一定的風(fēng)險。同時(shí)，這些啟動(dòng)子的轉錄調控模式單一，多受發(fā)酵碳源的嚴格阻遏，使大宗蛋白或化學(xué)品生產(chǎn)中的底物譜受限，很大程度上限制了其在更廣闊場(chǎng)景下的應用潛力。
近日，華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院蔡孟浩課題組在新型酵母表達設計方面取得重要進(jìn)展，開(kāi)發(fā)了可響應用戶(hù)自定義信號的高效畢赤酵母蛋白表達平臺，相關(guān)成果已在線(xiàn)發(fā)表于 Science Advances 上。
可響應用戶(hù)自定義信號：
只需找到已報道的、或用戶(hù)自定義篩選條件通過(guò)組學(xué)篩選的低強度啟動(dòng)子，即可接入 SynPic-X 平臺（高效表達的畢赤酵母平臺）實(shí)現響應用戶(hù)自定義條件的高效表達。理論上，通過(guò)目前的測序和組學(xué)技術(shù)，較易篩選獲得低強度啟動(dòng)子。

借此機會(huì )，生輝 SynBio 邀請到了蔡孟浩來(lái)與我們分享他的研究進(jìn)展。
圖丨蔡孟浩（來(lái)源：受訪(fǎng)者提供）
蔡孟浩本科畢業(yè)于華東理工大學(xué)理工優(yōu)秀生部，隨后保研到華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院張元興教授和周祥山教授課題組進(jìn)行碩博連讀，期間還前往英國布里斯托大學(xué)化學(xué)院 Russell J. Cox 教授課題組進(jìn)行聯(lián)合培養，開(kāi)展真菌聚酮****物的組合生物合成及發(fā)酵工程研究?，F為華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院副教授、博士生導師、生物反應器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室 PI，獲得國家高層次特殊支持計劃青年拔尖人才、上海市青年科技啟明星計劃資助。
“盡管組合生物合成是合成生物學(xué)的方向之一，但其化學(xué)學(xué)科屬性更強，因此上學(xué)期間我對合成生物學(xué)并不了解。直到 2014 年參加了冷泉港亞洲合成生物學(xué)國際會(huì )議，在聆聽(tīng)麻省理工學(xué)院 Christopher Voigt 教授的 “Programming cells as a placeholder” 主題演講后，如醍醐灌頂，決定融合以往的科研經(jīng)歷，開(kāi)設合成生物學(xué)研究方向?！?/span>
目前，其主要研究方向聚焦畢赤酵母新型細胞工廠(chǎng)創(chuàng )制與應用，包括特色酵母元器件設計、新型酵母底盤(pán)開(kāi)發(fā)、重組蛋白表達及天然產(chǎn)物合成應用。
即插即用的新型酵母表達平臺
“畢赤酵母作為底盤(pán)細胞，在工業(yè)中廣泛用于蛋白表達，但表達過(guò)程中需要一個(gè)強誘導型啟動(dòng)子。這個(gè)菌常用的 P_AOX1（醇氧化酶基因）啟動(dòng)子雖強度較強，但嚴謹性也高，有且只有甲醇存在的條件下，才能誘導開(kāi)啟，若混雜其他碳源，就會(huì )產(chǎn)生阻遏而無(wú)法表達，因此使用場(chǎng)景相對較窄，產(chǎn)品體量較小?！?蔡孟浩說(shuō)道。
隨著(zhù)工業(yè)生物技術(shù)體系快速發(fā)展，未來(lái)生物制造的體系需做到很大規模。但畢赤酵母僅能利用甲醇進(jìn)行高效誘導表達的特性存在三方面的問(wèn)題。其一，甲醇具有毒性，大規模生物制造時(shí)考慮成本問(wèn)題產(chǎn)品往往無(wú)法做到很精細的純化，比如若用于制造食品，則會(huì )給人體帶來(lái)傷害；其二，甲醇易燃易爆，大規模生物制造使用時(shí)的安全性仍需評估；其三，大規模應用需考慮成本問(wèn)題，低成本意味著(zhù)工業(yè)發(fā)酵時(shí)復合原料底物可能會(huì )混有多種阻遏碳源，這會(huì )阻遏畢赤酵母對甲醇的代謝利用，并且與其只能在甲醇存在的條件下誘導表達相矛盾。
“基于這三方面問(wèn)題，我們希望畢赤酵母作為底盤(pán)細胞既能保持它的強表達優(yōu)勢，同時(shí)也具有較強魯棒性?！币虼?，蔡孟浩課題組歷時(shí)八年對畢赤酵母進(jìn)行三代改造，使其能突破單一甲醇誘導的高效表達蛋白。
他介紹道，第一代體系主要解決的是畢赤酵母甲醇調控過(guò)于嚴謹問(wèn)題，通過(guò)解析誘導甲醇的轉錄調控機制，找到一個(gè)關(guān)鍵的轉錄激活因子，發(fā)現該轉錄因子與其他幾個(gè)轉錄因子在響應甲醇信號過(guò)程中存在級聯(lián)傳遞機制?；诖藱C制，對畢赤酵母進(jìn)行了代謝工程層面的改造。簡(jiǎn)單改造后能夠讓畢赤酵母實(shí)現部分甲醇誘導的碳源脫阻遏，可以用葡萄糖和甘油產(chǎn)生類(lèi)似誘導的效應，但表達能力沒(méi)有甲醇強。
為解決此問(wèn)題，蔡孟浩課題組利用合成生物學(xué)技術(shù)設計了簡(jiǎn)單遺傳線(xiàn)路，最核心的是通過(guò)人工設計的方式讓激活因子更好地結合啟動(dòng)子，激發(fā)其表達，改造之后的第二代體系表達強度得到提升。但由于轉錄放大效應，滲漏表達也提高了。在工業(yè)生產(chǎn)中，畢赤酵母生長(cháng)階段盡量不期望出現產(chǎn)物的合成，否則會(huì )給細胞代謝帶來(lái)較重負擔，最終影響生物量和產(chǎn)物量。
因此第三代要解決的是進(jìn)一步去除滲漏表達問(wèn)題，同時(shí)保持畢赤酵母很高的表達強度。蔡孟浩課題組通過(guò)分析畢赤酵母天然轉錄調控網(wǎng)絡(luò )并重塑轉錄調控機器，設計了一套具有高強度表達能力的轉錄信號增益器件 iTSAD，實(shí)現輸入信號的高效放大，達到商業(yè)化畢赤酵母 P_AOX1 表達強度的 5.2 倍。
同時(shí)，針對其介導的滲漏表達水平較高的問(wèn)題，基于 CRISPR 基因調控技術(shù)，設計 CRISPRi 阻遏器件以解決高滲漏表達問(wèn)題，并設計 CRISPRa 激活器件以抵消 CRISPRi 的高限表達壓制，以此可響應靈活、低強度輸入信號而協(xié)同控制 iTSAD 器件，有效解決高滲漏表達問(wèn)題，并通過(guò)對引導 RNA 組合的理性設計和篩選驗證，實(shí)現完整系統的高強度表達輸出。
圖 A丨響應自定義信號的合成型畢赤酵母平臺（SynPic-X）的開(kāi)發(fā)
由此，最終開(kāi)發(fā)成功具有高強度、低滲漏、可編程特性的合成型畢赤酵母表達平臺 SynPic-X?！斑@是一個(gè)通用型的高強度、可編程平臺，通過(guò)簡(jiǎn)單地 “插拔” 已知的或簡(jiǎn)單組學(xué)篩選的單一低輸入啟動(dòng)子即可實(shí)現響應用戶(hù)自定義信號的高水平蛋白表達和嚴謹調控。”
有望產(chǎn)業(yè)化應用
目前，針對該表達平臺，蔡孟浩團隊輸入了不同類(lèi)型的啟動(dòng)子進(jìn)行檢驗，分別構建了鼠李糖信號響應系統 SynPic-R、甲醇信號響應系統 SynPic-M 和硫胺素信號響應系統 SynPic-T，均可實(shí)現對特定信號的嚴謹調控和高效響應，在激活狀態(tài)下分別達到商業(yè)化畢赤酵母 P_AOX1 表達強度的 3.8 倍、4.4 倍和 3.3 倍。
為了測試 SynPic-X 平臺的實(shí)際應用價(jià)值和潛力，蔡孟浩團隊還選取鼠李糖信號響應系統 SynPic-R 用于驅動(dòng)工業(yè)淀粉酶的表達，在 3 升反應器水平得到了與商業(yè)化畢赤酵母 P_AOX1 甲醇誘導表達相當的產(chǎn)量，且生產(chǎn)工藝控制更為綠色、安全、簡(jiǎn)便，展現了良好的工業(yè)應用前景。
（來(lái)源：受訪(fǎng)者）
“下一步我們將繼續升級畢赤酵母細胞工廠(chǎng)，主要包括兩個(gè)方面，其一是設計開(kāi)發(fā)多底物協(xié)同利用型底盤(pán)，以滿(mǎn)足大規模蛋白及天然產(chǎn)物制造的低成本、高魯棒性需求；其二是設計開(kāi)發(fā)翻譯后修飾定制型底盤(pán)，以滿(mǎn)足動(dòng)植物源****用活性分子的高活性和高效生物合成需求。”
除了畢赤酵母發(fā)酵平臺，蔡孟浩團隊還建有絲狀真菌和大腸桿菌發(fā)酵平臺體系，其中，畢赤酵母發(fā)酵平臺主要針對重組蛋白及小分子****物、新型食品替代蛋白；絲狀真菌發(fā)酵平臺主要針對天然****物及色素；大腸桿菌發(fā)酵平臺主要針對特殊功能酶等。
蔡孟浩說(shuō)道，“我們前期開(kāi)發(fā)的畢赤酵母表達系統及蛋白****物表達應用已經(jīng)實(shí)現企業(yè)轉讓?zhuān)瑫r(shí)在新型替代蛋白、抗衰****物開(kāi)發(fā)方面也在與企業(yè)開(kāi)展密切的研發(fā)合作，有望在 1~2 年內實(shí)現產(chǎn)業(yè)化應用。”
采訪(fǎng)最后，蔡孟浩老師也向我們分享了他的科研經(jīng)驗和培養學(xué)生的心得體會(huì )，他認為研究要 “博觀(guān)約取”，廣泛汲取新學(xué)術(shù)思想和技術(shù)方法，但也要以應用出口為導向進(jìn)行謹慎選取和融合，基于此的 “機制 - 重構 - 應用” 研究思路和目標會(huì )更加明確，適合應用基礎研究體系。
在培養學(xué)生方面，要引導（建立思路）、鼓勵（提升信心）、敦促（增強動(dòng)力）相結合，這對于學(xué)生的獨立和快速成長(cháng)非常重要。
參考資料：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abl5166

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