可編輯堿基對長(cháng)度從幾十擴至數千，「先導編輯」系統讓治療復雜遺傳病成為可能？業(yè)內人士：遞送挑戰仍存，長(cháng)期安全性有待觀(guān)察

在剛剛結束的 2021 年，基因編輯領(lǐng)域交出了令人較為欣喜的成績(jì)單。

6 月，諾獎得主 Jennifer Doudna 創(chuàng )辦的公司 Intellia 和再生元共同發(fā)布一項 CRISPR 候選****物臨床 I 期試驗中期數據，結果表明該****物實(shí)現了對患者肝臟內細胞的基因編輯，且安全性良好。這一試驗結果以題為“CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis”的文章發(fā)表在國際頂尖醫學(xué)期刊 The New England Journal of Medicine (NEJM) 上，為全球范圍內首個(gè)公開(kāi)報告的體內 CRISPR 基因編輯療法臨床試驗結果，并被 Science 納入當年 “年度十大科學(xué)突破”。

12 月，基因編輯領(lǐng)域知名科學(xué)家劉如謙（David R. Liu）團隊在 Nature Biotechnology 上發(fā)表論文表示，其對基因編輯系統 “先導編輯”（Prime Editor，以下簡(jiǎn)稱(chēng) PE）進(jìn)行了更新，新版本的 PE（PE3.0）在人類(lèi)細胞中可編輯的基因長(cháng)度擴展至數千對堿基（長(cháng)度相當于一條完整的基因），而上一版本系統中這一數字為數十。這一突破被認為是基因編輯治療向更安全、更精準邁出的重要一步。

“實(shí)現大片段堿基對的修復，有助于擴寬基因編輯技術(shù)治療疾病的范圍?！?nbsp;瑞典卡羅琳斯卡醫學(xué)院副教授鄭宗立對生輝如此表示。

其實(shí)，回顧 20 世紀末至今，基因編輯領(lǐng)域共出現三大主流技術(shù)，從 ZFN、TALENs，再到如今被廣泛使用的 CRISPR/Cas 系統，基因編輯效率不斷提高，應用范圍逐漸擴大，為基因功能研究提供有力工具的同時(shí)，也讓傳統手段無(wú)法醫治的復雜疾病看到可被治療的希望。

從工作機制上看，ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 都是在基因組靶標位點(diǎn)引起 DNA 雙鏈斷裂，進(jìn)而激活細胞自我修復機制，完成基因的編輯。只是，與 ZFN 和 TALEN 技術(shù)需靶向 DNA 序列中特異性蛋白誘發(fā) DNA 雙鏈的斷裂不同，CRISPR/Cas 系統則避免了這一繁瑣的步驟，通過(guò)利用一段特定序列的向導 RNA 分子（guide RNA，gRNA）將核酸內切酶引至靶點(diǎn)，更高效地完成基因編輯，這也是 CRISPR/Cas 技術(shù)得以廣泛應用的原因。

這三種基因編輯方法下，可有效改變基因的表達，但缺少對基因編輯結果的掌控：DNA 雙鏈斷裂后的自我修復過(guò)程中，較易引起隨機插入、缺失的異源末端連接以及需要同源模板才可激活同源重組修復的情況，存在一定的不確定性。

面對這一問(wèn)題，科學(xué)家在不斷探索新的方案。2016 年，David Liu 團隊在 Nature 發(fā)表論文表示，他們開(kāi)發(fā)了 CRISPR-Cas9 單堿基編輯器，可在不導致 DNA 雙鏈斷裂的情況下實(shí)現對基因組點(diǎn)突變的定向修改；2019 年，David Liu 團隊公布其基于 CRISPR-Cas9 開(kāi)發(fā)的無(wú)需 DNA 雙鏈斷裂的基因編輯系統 ——Prime Editor（“先導編輯” 系統），相關(guān)論文發(fā)表在 Nature 上。

可以說(shuō)，CRISPR/Cas 打開(kāi)了高效基因編輯的新局面，而在此基礎上實(shí)現的 Prime Editor 實(shí)現了更精準的基因編輯。

如上述提到的 David Liu 團隊 2019 年所發(fā)文章標題所示，Prime Editor 是一款遵循 “查找 - 替換”（search-and-replace）邏輯運行的基因編輯系統。

為實(shí)現如文字編輯器中方便快捷的 “查找 - 替換” 工具效果，他們率先對 CRISPR-Cas9 系統兩大組成部分 ——Cas9 酶和 gRNA 進(jìn)行了 “替換”：一方面將向導 RNA 分子進(jìn)行改造，在其 3' 端添加一段 RNA 序列，即引物結合序列（Primer binding site，PBS）和轉錄模版序列（RT template），形成能夠結合特定目標基因且自帶基因編輯模板的 RNA 分子，被稱(chēng)作基于改造的向導 RNA（the engineered guide RNA ，the pegRNA）；另一方面，用 Cas9 切口酶（Cas9 nickase）和逆轉錄酶融合而成的蛋白復合體替換 Cas9 酶

該 PE 系統之下，Cas9 切口酶可在 pegRNA 指引下定位到目標位置，對 DNA 單鏈進(jìn)行切割。之后 pegRNA 3′端的引物結合序列與切斷前的互補序列識別配對，逆轉錄酶以 pegRNA 上與引物結合序列形成后的序列為模板進(jìn)行逆轉錄，將目標序列聚合至切斷的 DNA 鏈上。接下來(lái)，細胞將通過(guò)自身的 DNA 修復機制把新的 DNA 序列整合到基因組。

這樣，在 pegRNA 的 “限制” 下，該系統可有效減少脫靶效應，在切斷 DNA 單鏈的情況下，實(shí)現對堿基的精準轉換、插入和缺失等，最多可插入 44bp，或刪除 80bp，若超過(guò) 100bp 的 DNA 片段，系統編輯效率將會(huì )降低。這一研究論文中提到，理論上，PE 系統可對人類(lèi) 89% 遺傳疾病相關(guān)的基因變異進(jìn)行糾正。

但應用于實(shí)際研究或治療人類(lèi)遺傳疾病，需要編輯的 DNA 片段要更長(cháng)。為擴大基因編輯技術(shù)研究和治療疾病的范圍，在那之后，David Liu 團隊對 PE 系統進(jìn)行了兩次升級。

他們發(fā)現，PE 系統中使用的 pegRNA3' 端降解導致系統活性降低，為基因編輯效率較低的一大原因。對此，David Liu 團隊開(kāi)發(fā)了工程化的 pegRNA，將 PE 系統基因編輯效率提升 3-4 倍。這一研究進(jìn)展于 2021 年 10 月發(fā)表在 Nature Biotechnology 上。

12 月，David Liu 團隊 PE 系統的升級版 “twinPE” 在 Nature Biotechnology 上發(fā)布，使用 twinPE 系統，可插入、替換或刪除的序列長(cháng)度約為 800bp。在 twinPE 系統中，David Liu 團隊將 pegRNA 增加至兩條，進(jìn)行基因編輯過(guò)程中，這兩條 pegRNA 將在特定位置分別對 DNA 鏈進(jìn)行切割。同樣是 DNA 雙鏈斷裂，不同的是，twinPE 選擇在不同位置對 DNA 雙鏈進(jìn)行切割，確保 DNA 雙鏈不完全斷裂，實(shí)現基因編輯結果的可控性。

此次研究中，他們在人體細胞中對引起罕見(jiàn)遺傳病亨特綜合征（Hunter syndrome）的相關(guān)基因進(jìn)行了編輯，該疾病由長(cháng)度為 4000bp 的 DNA 片段導位引起。研究人員使用 twinPE 將數千堿基對大小的 DNA 片段精確插入到基因組的異常位點(diǎn)。

這表明，twinPE 系統具備應用于大型基因突變所致遺傳疾病治療的潛力。

然而，對于基因治療領(lǐng)域繞不開(kāi)的遞送問(wèn)題，PE 系統自然也不例外。而且，“ Priem Editor 帶有的逆轉錄酶比較大，更增加了遞送難度?！?/span>

除此之外，“基因治療面臨的挑戰還包括精確的編輯（PE仍可產(chǎn)生Indel副產(chǎn)物）、未知的人體系統免疫反應以及脫靶等長(cháng)期安全性問(wèn)題”。鄭宗立說(shuō)道，該系統引入的逆轉錄酶對于人體屬于“外來(lái)物”，它是否會(huì )對細胞及人體產(chǎn)生潛在的影響，還需要長(cháng)期的觀(guān)察。
過(guò)去兩年，全球體內基因編輯療法開(kāi)始進(jìn)入臨床，首例人體試驗數據也在去年公布。而對于基因編輯技術(shù)更大規模地應用于臨床，鄭宗立表示，長(cháng)期安全性、有效性問(wèn)題仍是最大的挑戰。
參考資料：

• https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4
• https://www.science.org/content/article/breakthrough-2021#section_breakthrough
• https://www.nature.com/articles/s41587-021-01133-w
• https://www.broadinstitute.org/news/new-prime-editing-system-inserts-entire-genes-human-cells
• https://www.broadinstitute.org/news/new-crispr-genome-editing-system-offers-wide-range-versatility-human-cells
• https://mp.weixin.qq.com/s/9A6Vsxgz0IXaJ7e3L68Cmw
• https://baike.baidu.com/tashuo/browse/content?id=a800080106745dd97170f31f