90后科研伉儷發(fā)現ASA6新抗體，可減少動(dòng)脈硬化斑塊形成，有望用于動(dòng)脈粥樣硬化靶向診斷和治療

在青島大學(xué)讀碩士期間，張立煒完成了研究的主要部分，當時(shí)王語(yǔ)是張立煒隔壁課題組的師姐，也因為合作這次研究相識相知。目前，兩人已經(jīng)領(lǐng)證成家，且也都在德國讀博。
9 月 28 日，相關(guān)論文以《用于動(dòng)脈粥樣硬化的 MR/NIR-II 成像和抗動(dòng)脈粥樣硬化治療的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊靶向單鏈抗體》（An atherosclerotic plaque-targeted single-chain antibody for MR/NIR-II imaging of atherosclerosis and anti-atherosclerosis therapy）為題發(fā)表在 Journal of Nanobiotechnology 上，張立煒擔任第一作者，王語(yǔ)是第六作者，在薛升教授的指導下，張立煒等人順利完成了這一研究。


今年 7 月，《中國心血管健康與疾病報告 2020》發(fā)布，報告顯示中國心血管病患病率處于持續上升態(tài)勢，患病人數約 3.3 億，其中冠心患者約 1139 萬(wàn)。冠心病本屬于 “老年病”，但發(fā)病年齡也在逐漸降低。更令人擔心的是，報告顯示“心血管病致死”居中國城鄉居民總死亡原因首位。這說(shuō)明，年輕人對 “心” 要 “上心”。


而張立煒發(fā)現的 ASA6，能和氧化的低密度脂蛋白以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結合，并能抑制巨噬細胞對低密度脂蛋白的攝取，從而減少巨噬細胞的凋亡。

在臨床工作中，張立煒發(fā)現缺血性心肌病并不完全由于冠脈血管性病變導致，常常會(huì )有其他原因導致與冠心病相似的臨床癥狀。同時(shí)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病也存在個(gè)體差異性，但絕大部分缺血性心肌病患者均需進(jìn)行冠脈造影術(shù)。

雖然冠脈造影術(shù)屬于微創(chuàng )手術(shù)，但從臨床角度觀(guān)察，患者由于各種原因也對此手術(shù)存在抵觸心理，同時(shí)也需要承擔價(jià)格不菲的造影費用。因此，從臨床角度出發(fā)，如何尋找一個(gè)患者接受度高價(jià)格又相對實(shí)惠的診斷方法，成為他想進(jìn)行此項研究開(kāi)發(fā)的初衷。


一般來(lái)講，缺血性心肌病患者需要首先進(jìn)行血脂血糖心臟 B 超等常規檢查，進(jìn)而輔助臨床醫生來(lái)判斷是否對患者進(jìn)行冠脈造影術(shù)。但通過(guò)常規的臨床檢查，臨床醫生依靠經(jīng)驗很難確切地了解冠狀動(dòng)脈血管內的堵塞程度，因此一部分患者在做完冠脈造影術(shù)后發(fā)現并不是血管源性缺血性心肌病。

另外，通常情況下，患者先是接受冠脈造影術(shù)，此后根據個(gè)人情況進(jìn)行冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)（PCI 術(shù)），但也存在一些相對特殊的情況，如患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化鈣化情況過(guò)于嚴重，并不適于進(jìn)行 PCI 術(shù)。這些情況依靠臨床經(jīng)驗很大程度上無(wú)法有效避免。

另外值得注意的是，動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)際上是一種全身性的疾病，只是冠狀動(dòng)脈位于心臟這一關(guān)鍵位置，所以冠心病患者的臨床癥狀較為明顯。同樣，動(dòng)脈粥樣硬化也是腦卒中的病理生理學(xué)基礎之一。

總結這些因素，是否能夠開(kāi)發(fā)一個(gè)能一次性診斷全身動(dòng)脈粥樣硬化、易于實(shí)現、并且患者接受度高的方法呢？同時(shí)，是否可以開(kāi)發(fā)一種即可用于臨床診斷、又可用于臨床治療的方法呢？帶著(zhù)這些初衷，張立煒開(kāi)發(fā)了全新的基于抗體靶向的診斷和治療方案。

張立煒介紹，該項技術(shù)首先從病理生理學(xué)上驗證了對于自身脂代謝異常，人體自身免疫系統仍然可以產(chǎn)生有效的抗體，但這部分抗體的自身產(chǎn)生量無(wú)法有效抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。

不過(guò)，這部分抗體的編碼序列被保存在淋巴細胞的基因序列當中。因此，可以利用這些被保存的基因序列在體外進(jìn)行抗體重組、大規模生產(chǎn)和效果驗證等一系列操作。同時(shí)，該項研究也是 2018 年諾貝爾化學(xué)獎——噬菌體展示技術(shù)的最新應用。

有趣的是，張立煒發(fā)現他篩選出的抗體，可以誘導動(dòng)脈粥樣硬化血管中的細胞產(chǎn)生 “線(xiàn)粒體阻滯” 效應，這是該研究最有趣且意外的發(fā)現。目前尚不清楚該效應確切的觸發(fā)機制、以及該效應所產(chǎn)生的血管保護作用的確切機制。但這為未來(lái)的研究提供了很好的方向和理論基礎。

研究中，張立煒先從臨床中獲得 55 例通過(guò)冠脈造影術(shù)明確診斷為血管動(dòng)脈粥樣硬化患者的外周血，并從中分離了淋巴細胞。此后對這些淋巴細胞進(jìn)行逐個(gè)的 Total RNA 提取并此過(guò)程中評估了 RNA 質(zhì)量，進(jìn)而對反轉并池化，最終獲得 55 例患者淋巴細胞 cDNA 文庫。

值得注意的是，人體產(chǎn)生的抗體在基因編碼層面存在保守序列，類(lèi)似不同抗體序列均存在 “這是抗體序列” 的標簽。因此，在下一步中張立煒利用這些標簽作為 PCR 體外擴增的引物，將 cDNA 文庫中抗體編碼序列全部一次性擴增出來(lái)。最后通過(guò) SOE-PCR 將編碼抗體長(cháng)鏈和短鏈的基因序列拼接起來(lái)，形成人源抗體基因序列文庫。

接下來(lái)他將該抗體文庫插入質(zhì)粒當中并導入大腸桿菌中，使得所有大腸桿菌成為下一步噬菌體展示的“食物工廠(chǎng)”。然后使用 M13 型噬菌體對這些大腸桿菌文庫進(jìn)行侵染。

噬菌體進(jìn)入大腸桿菌后，對利用大腸桿菌體內的營(yíng)養物質(zhì)重組產(chǎn)生新的噬菌體，但此過(guò)程中噬菌體會(huì )把他導入的抗體序列庫翻譯，并表達在噬菌體的蛋白 “帽子” 上。

接下來(lái)，他從臨床上收集了若干動(dòng)脈粥樣硬化的人體血管樣本，并利用這些新產(chǎn)生的噬菌體對其進(jìn)行了噬菌體展示篩選，最終淘選出大約 106 個(gè)陽(yáng)性噬菌體，這其中每個(gè)噬菌體均存在一種特異性靶向動(dòng)脈粥樣硬化板塊的陽(yáng)性抗體。隨后，張立煒從中挑選了一種親和力最高的抗體并命名為 ASA6。

緊接著(zhù)，他將含有 ASA6 的噬菌體再次導入相應的大腸桿菌，提取質(zhì)粒并導入另外一種大腸桿菌，使其成為抗體大規模組裝的體外 “工廠(chǎng)”。

最終經(jīng)過(guò)悉心繁殖和培養，張立煒從中提取并獲得了足量的 ASA6 抗體。并在體外通過(guò)蛋白印跡和免疫熒光等方法，進(jìn)一步驗證了 ASA6 對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的高親和力和特異性。

據他介紹，在蘇州大學(xué)放射醫學(xué)與輻射防護國家重點(diǎn)實(shí)驗室李楨教授的幫助下，他和團隊合成了含有金屬釓和金屬釹的納米顆粒，通過(guò) EDC-NHS 反應將納米顆粒與抗體進(jìn)行了偶聯(lián)，并通過(guò)透射電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射儀等方法對偶聯(lián)物進(jìn)行了物質(zhì)形態(tài)的表征。

同時(shí)，他也對該偶聯(lián)物進(jìn)行了生物相容度實(shí)驗，結果顯示該偶聯(lián)物并不會(huì )損傷實(shí)驗鼠的各個(gè)器官，偶聯(lián)物通過(guò)尿液有效排出體外。

此后，在核磁共振（NMR）和近紅外光（NIR）上，張立煒使用該偶聯(lián)物對高脂飲食的 ApoE 基因敲除鼠進(jìn)行了靶向斑塊的顯影。結果發(fā)現在兩種不同模態(tài)下，該偶聯(lián)物均可對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊具有有效的示蹤效果。

同時(shí)，他將 ASA6 注射到高脂飲食的 ApoE 基因敲除鼠中，觀(guān)察其對動(dòng)脈粥樣硬化的抑制效果，結果顯示 ASA6 可大大抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生。他也對這部分小鼠血管進(jìn)行了轉錄組分析，并明確了 ASA6 可誘導血管細胞產(chǎn)生 “線(xiàn)粒體阻滯” 效應，進(jìn)而抑制了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展?？傊?，這些數據證明了 ASA6 抗體在和無(wú)創(chuàng )成像中的潛力。

談及相關(guān)應用，張立煒表示，ASA6 抗體是一種人源性抗體。以往的抗體篩選，一般使用小鼠作為抗體篩選對象，但其篩選出的抗體為鼠源性抗體，對鼠源性抗體進(jìn)行人源化處理，是一個(gè)繁雜且耗時(shí)耗力的工程。

而該研究直接獲取人源性抗體，避免了后期人源化的麻煩，因此可直接進(jìn)行人體實(shí)驗。但仍面臨抗體組裝的問(wèn)題。

其次，ASA6- 納米顆粒偶聯(lián)物有望實(shí)現一次性對全身所有血管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的探測，高效且在大規模生產(chǎn)后大大降低臨床診斷費用以及獲得更為良好的患者接受度。

最后，本研究所發(fā)現的 “線(xiàn)粒體阻滯” 效應可為未來(lái)針對血脂代謝異常提供良好的病理生理學(xué)基礎和研究方向。未來(lái)對該效應進(jìn)行細致研究后，有望開(kāi)發(fā)出針對血脂代謝異常以及動(dòng)脈粥樣硬化的高效治療****物。

提起研究中最難忘的事情，張立煒說(shuō)由于他所在的研究所缺少一個(gè)探測設備，為此不得不驅車(chē)幾百公里前往蘇州大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室進(jìn)行實(shí)驗。其青島大學(xué)轉化實(shí)驗中心助理教授薛升為了他和小鼠的安全，親自開(kāi)車(chē)載他前往蘇州。一路上，小鼠的味道彌漫整個(gè)汽車(chē)，最終他們安全抵達蘇州。因此，我十分感激薛升教授對我無(wú)微不至的關(guān)懷和幫助。

另外，由于冠心病患者具有凌晨發(fā)病的特點(diǎn)。因此當時(shí)收取患者外周血常常需要半夜前往醫院收集，并到實(shí)驗室進(jìn)行下一步處理。張立煒說(shuō)，雖然自己在本科期間已經(jīng)獲得駕駛證，但一直不敢在真實(shí)路況開(kāi)車(chē)。在收集樣本的那段時(shí)間，他也得以明顯提高駕駛技術(shù)和膽量。

張立煒今年 26 歲，出生于山東省青島市，目前博士就讀于德國慕尼黑大學(xué)，并在德國亥姆霍茲糖尿病研究中心從事心血管疾病與糖尿病的相關(guān)研究。該研究完成于在青島大學(xué)讀碩期間，在國內時(shí)他還曾跟隨青島大學(xué)附屬醫院周長(cháng)勇教授從事臨床冠心病的診治工作。
對于未來(lái)張立煒表示，目前人工智能正在醫學(xué)行業(yè)興起。AlphaFold 2 的發(fā)布大大加快了蛋白質(zhì)結構解析和抗體行業(yè)的發(fā)展。他認為使用大規模訓練集完美預測抗體結合抗原，將成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

相比新興 AI 計算，傳統生物實(shí)驗室實(shí)驗仍存在效率低效、資源消耗嚴重的問(wèn)題。在這一問(wèn)題上，他將和愛(ài)人將繼續結合人工智能技術(shù)開(kāi)發(fā)出更高效的疾病相關(guān)抗體。
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