突變率提高23萬(wàn)倍、可一天完成變異篩選，新型定向進(jìn)化系統或可用于哺乳動(dòng)物細胞 | 專(zhuān)訪(fǎng)易嘯

在非哺乳動(dòng)物細胞中進(jìn)化得到的蛋白質(zhì)，常常會(huì )因錯誤的折疊修飾、分子間相互作用、錯誤的細胞定位等因素，無(wú)法在復雜的哺乳動(dòng)物細胞中正常工作。因此，開(kāi)發(fā)能夠應用于哺乳動(dòng)物細胞中的定向進(jìn)化技術(shù)是一大趨勢。

“我們開(kāi)發(fā)的 TADR 系統應用范圍更廣，在大腸桿菌、酵母甚至哺乳動(dòng)物細胞中都有應用潛力?！?易嘯說(shuō)。

易嘯是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為 “合成所”）研究員，博士師從明尼蘇達大學(xué)分子進(jìn)化學(xué)家 Antony Dean 教授學(xué)習種群遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)，并與其導師提出了生物多樣性的新理論，后期從理論轉向實(shí)驗研究。他在博士后期間與工程生物學(xué)結緣。

今年 7 月，易嘯作為第一作者和并列通訊作者在 Science Advances 上發(fā)表最新研究成果。該團隊利用合成生物學(xué)的方法開(kāi)發(fā)了一個(gè) “智能” 細菌系統 —— 靶向性人工 DNA 復制體（TADR），該系統能夠在活細胞內將大量突變快速靶向到指定的任意一段 DNA 序列上，而不會(huì )影響基因組的其他部分。

“TADR 系統將突變率提高了 23 萬(wàn)倍，一天即可完成變異篩選，快速進(jìn)化基因。我們正在探索潛在應用方向，比如說(shuō)用該系統進(jìn)化指定的大分子或者抗體?！?易嘯

TADR 系統是易嘯在博士后期間的一個(gè)合成生物學(xué)項目。在博士后研究階段，易嘯花費 5 年時(shí)間獨立設計開(kāi)發(fā)出了 TADR 系統，并獲得了相關(guān)技術(shù)的美國專(zhuān)利?，F在他已經(jīng)在合成所材料合成生物學(xué)中心成立了合成進(jìn)化實(shí)驗室，該實(shí)驗室的一大重點(diǎn)就是圍繞 TADR 系統展開(kāi)基礎研究和探索應用場(chǎng)景，解決科學(xué)和生產(chǎn)問(wèn)題。 

易嘯坦言，現階段，TADR 系統是其在研究生涯過(guò)程中最有成就感的一項研究。

將突變率提高 23 萬(wàn)倍，一天即可完成變異篩選

細胞外突變法是目前最為成熟且直觀(guān)的一種定向進(jìn)化方法，包括易錯 PCR（error-prone PCR）、易突變菌株（mutator strains of bacteria）以及可產(chǎn)生非隨機突變的定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）等。

然而，這種方法往往需要密集的人工操作，多數情況下只能在有限的突變庫上進(jìn)行一輪進(jìn)化。如果想要得到更有優(yōu)勢的蛋白質(zhì)，或者完成更復雜的定向進(jìn)化目標，就需要更大體量的突變庫，以及進(jìn)行多輪迭代進(jìn)化。

為了突破這些瓶頸，加快進(jìn)化速度，更快獲得更復雜的進(jìn)化目標，研究人員開(kāi)始嘗試開(kāi)發(fā)細胞內突變方式。

易嘯團隊開(kāi)發(fā)的 TADR 系統就是一種細胞內突變方法，整個(gè)進(jìn)化過(guò)程在活細胞里面完成。TADR 系統系統也叫最簡(jiǎn) DNA 復制體，是由三個(gè)蛋白質(zhì)組成的蛋白復合體，分別為噬菌體蛋白 CisA、細菌 Rep 解旋酶、T5 噬菌體 DNA 聚合酶的出錯性突變子。

該系統能夠在短時(shí)間內把大量突變靶向指定的 DNA 上面，同時(shí)保留基因組其他部分的完整性。

具體來(lái)說(shuō)，他找到了一種噬菌體，其在天然復制過(guò)程中有一個(gè)能夠特異性識別 30 堿基對序列的蛋白，識別以后，噬菌體就從該位點(diǎn)開(kāi)始復制 DNA。所以他把出錯率高的 DNA 聚合酶融合到了這個(gè)噬菌體的蛋白上，利用這個(gè)噬菌體的蛋白去把出錯率高的 DNA 聚合體靶向到指定突變的 DNA 上游。

易錯 PCR 是一種簡(jiǎn)便快速在 DNA 序列中隨機制造突變的方法，通過(guò)改變傳統 PCR 反應體系中的 Mg2+ 濃度、dNTP 的濃度比例、pH 值等，使堿基在一定程度上隨機引入錯誤而創(chuàng )造序列多樣性文庫。這種方法的關(guān)鍵在于控制合適的突變頻率，較低的突變率能夠積累大部分的有益突變，而較高的錯摻率則會(huì )產(chǎn)生中性突變或有害突變。

“與基于出錯 PCR 和體外質(zhì)粒構建的傳統定向進(jìn)化方法相比，TADR 可以避免分子連接、細胞轉化等效率極低的步驟，從而實(shí)現在活細胞內快速連續進(jìn)化分子和細胞表型的潛力。” 易嘯說(shuō)。

該團隊進(jìn)一步對 TADR 系統進(jìn)行了量化，研究表示，與野生型突變速率相比，TADR 的突變速率提高了約 23 萬(wàn)倍，即 2.3*10^5。

易嘯表示，該系統可以快速找到非常低頻的有益突變，加速分子突變速率。比如說(shuō)，使用傳統方法可能需要一個(gè)星期，利用 TADR 只需一天即可完成變異篩選。

該系統可能會(huì )與合成所大設施的功能結合起來(lái)，相當于添加了一個(gè)分子突變的功能檔。易嘯透露，還需要在功能檔上加一個(gè)細菌生長(cháng)培養的模塊。最終與大設施形成一個(gè)連續突變和大規模篩選的閉環(huán)，不斷繼續循環(huán)，能夠非?？焖僭趯?shí)驗室里面進(jìn)化出我們想要的大分子。

操作簡(jiǎn)單，應用場(chǎng)景更廣

在細胞內連續突變領(lǐng)域，目前已有兩大成熟系統，一是哈佛大學(xué)劉如謙團隊于 2011 年開(kāi)發(fā)的噬菌體輔助的連續進(jìn)化方法（phage-assisted continuous evolution，PACE），另一種方法是加州大學(xué)爾灣分校教授 Chang C. Liu 開(kāi)發(fā)的一種正交 DNA 聚合酶 - 復制子系統（orthogonal DNA replication，OrthoRep）。

PACE 系統在許多蛋白質(zhì)進(jìn)化應用中已經(jīng)得到了驗證，但是只有與細菌中基因轉錄相關(guān)時(shí)，PACE 系統才可以進(jìn)化給定的目標蛋白。也就是說(shuō)，給定的目標蛋白只能在大腸桿菌細胞質(zhì)進(jìn)化，折疊不良或者需要翻譯后修飾都會(huì )妨礙利用 PACE 系統的進(jìn)化。 

與 PACE 系統類(lèi)似，OrthoRep 系統對生物物種也有選擇性，需要與酵母增殖活動(dòng)相關(guān)，只能在酵母（真核細胞）中才能進(jìn)行功能性表達。

“這兩大系統在概念上實(shí)現了一定的創(chuàng )新，可以相應解決一些問(wèn)題，但是存在一定的局限性，很多分子進(jìn)化問(wèn)題無(wú)法利用這兩個(gè)系統解決，應用場(chǎng)景受限?！?易嘯說(shuō)。

正是看到了這兩大系統各自存在的盲區，易嘯在博士后研究期間專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)一種可以在哺乳動(dòng)物甚至更多生物物種中使用的系統。

在論文中，易嘯利用合成生物學(xué)思路構建了 TADR 系統，該系統結構簡(jiǎn)單，可以實(shí)現模塊化，比如說(shuō)關(guān)閉 TADR 系統后，細胞和目標質(zhì)粒仍然能夠繼續增殖。模塊化能力也提供了 TADR 擴展到其他細胞類(lèi)型甚至無(wú)細胞系統中的可能性。 

易嘯介紹，TADR 系統比前兩個(gè)系統操作更加簡(jiǎn)單，更容易上手。從原理上講，它可能在酵母、甚至哺乳動(dòng)物細胞中快速進(jìn)化，應用場(chǎng)景很廣，幾乎沒(méi)有限制。 

“我的實(shí)驗室接下來(lái)將會(huì )開(kāi)展相關(guān)研究，把該系統應用到不同的物種中，進(jìn)一步擴大應用范圍。” 易嘯繼續補充。

現階段，易嘯將該系統的應用方向瞄準了材料領(lǐng)域，現已與合成所材料合成生物學(xué)中心研究員鐘超進(jìn)行了深入交流。

“材料研究涉及到物理、化學(xué)原理和實(shí)驗，而這些也恰恰是做進(jìn)化、篩選的基礎。實(shí)現物理、化學(xué)、生物的交叉融合，這是一個(gè)比較新的應用方向，我們可以在實(shí)驗室快速進(jìn)化和篩選活體材料所需的性質(zhì)，加強現有材料性質(zhì)，甚至進(jìn)化出一些原本不存在的材料性質(zhì)?！?/span>

“合成所的學(xué)術(shù)氛圍就像年輕人共同創(chuàng )業(yè)”

今年是易嘯回到合成所成立實(shí)驗室開(kāi)展研究工作的第一個(gè)年頭，他于 2008 年本科畢業(yè)后赴美攻讀博士學(xué)位，加入合成所之前，他已經(jīng)在海外求學(xué) 12 載。

對于易嘯來(lái)說(shuō)，TADR 系統的設計和開(kāi)發(fā)工作也并非一帆風(fēng)順。

“在美國進(jìn)行博士后期間，我用了整整 5 年才開(kāi)發(fā)出 TADR 系統。其中前 3 年半全部都在試錯，而且失敗得一塌糊涂，TADR 系統最開(kāi)始的設計和現在的設計幾乎完全不同，所以開(kāi)發(fā)出的系統一直存在缺點(diǎn)。直到最后一年半時(shí)間，TADR 才開(kāi)始達到預期，可想而知，我在前 3 年半時(shí)間面臨的一些困難和內心的煎熬?！?易嘯回憶道。

在他看來(lái)，科研工作中總是會(huì )經(jīng)歷或大或小的挫折，我認為在這期間最重要的是要對科研工作保持堅持執著(zhù)的心態(tài)。

“作為一線(xiàn)科研人員，我們需要做一些科學(xué)探索工作，不斷探索人類(lèi)未知的前沿領(lǐng)域，發(fā)現新概念，甚至顛覆一些陳舊的認知。同時(shí)還需要有一定的社會(huì )關(guān)懷，制定與社會(huì )利益相關(guān)的遠大目標?！?易嘯說(shuō)。

這一點(diǎn)也與中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)深圳先進(jìn)院）“頂天立地” 的理念也不謀而合。即 “天” 是學(xué)問(wèn)，“地” 是產(chǎn)業(yè)，“頂天立地” 理念貫穿于深圳先進(jìn)院十個(gè)所的發(fā)展始終，作為其中較為年輕且發(fā)展迅猛的研究所，合成所亦是如此。換言之，造物致知就是頂天，造物致用就是立地。

“ 合成所的學(xué)術(shù)氛圍很活躍，老師們也都很年輕，加入合成所就好像一幫年輕人共同去創(chuàng )業(yè)，大家一起去干一番自己的事業(yè)。” 易嘯坦言。

關(guān)于未來(lái)的發(fā)展規劃，易嘯將重點(diǎn)圍繞兩個(gè)研究方向：第一個(gè)方向是偏向于基礎科學(xué)研究，在實(shí)驗室進(jìn)化細胞，將統一進(jìn)化過(guò)程重復 N 次，探索生命體的可能空間；第二個(gè)方向是基于 TADR 的工程應用，在三年內使該技術(shù)更成熟，未來(lái)可以讓蛋白質(zhì)工程、大分子開(kāi)發(fā)人員等更多科研人員都可以用上 TADR 系統。

同時(shí)，觀(guān)鳥(niǎo)是易嘯的愛(ài)好之一，辦公桌上的望遠鏡、單反相機都是他觀(guān)鳥(niǎo)的必備神器。最近易嘯老師會(huì )在深圳先進(jìn)院旁邊的大沙河公園中用無(wú)人機拍水鳥(niǎo)，“以鷺這種類(lèi)型的鳥(niǎo)為例，在大沙河上基本都能夠找到，比如蒼鷺、大白鷺、小白鷺，夜鷺……”