免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗方法及其分類(lèi)

　　二、熒光抗體染色方法及其分類(lèi)

　　1.直接染色法

　　將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見(jiàn)到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高，操作簡(jiǎn)便，比較快速。缺點(diǎn)是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽(yáng)性標本對照，抑制試驗對照。

　　2.間接染色法

　　如果檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進(jìn)行反應，作用一定時(shí)間后，洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標本反應，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應，則抗體被固定或與熒光素標記的抗抗體結合，形成抗原-抗體-抗抗體復合物，再洗去未反應的標記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標記的抗體起著(zhù)雙重作用，對抗原來(lái)說(shuō)起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

　　由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動(dòng)物血清球蛋白免疫其他動(dòng)物來(lái)制備。

　　間接染色法的優(yōu)點(diǎn)是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點(diǎn)是：由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結果有時(shí)較難，操作繁瑣，對照較多，時(shí)間長(cháng)。間接法應設陰、陽(yáng)性標本對照，還應設有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽(yáng)性血清）。

　　3.抗補體染色法

　　抗補體染色法簡(jiǎn)稱(chēng)補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標記的抗體和補體加在抗原標本上，使其發(fā)生反應，水洗，然后再加標記的抗補體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應，形成復合物，則補體便被抗原抗體復合物結合，第二步加入的熒光素標記的抗補體抗體便與補體發(fā)生特異性反應，使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發(fā)出熒光。

　　抗補體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點(diǎn)，此外，還有其獨特的優(yōu)點(diǎn)：即只需要一種標記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統。因為補體的作用沒(méi)有特異性，它可以與任何哺乳動(dòng)物的抗原-抗體系統發(fā)生反應。它的缺點(diǎn)是參與反應的成分多，染色程序較復雜，比較麻煩。

　　除上述三種方法外，還有在此基礎上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補體法等等。