基于生物發(fā)光技術(shù)的細菌總數快速檢測儀

　　岳偉偉，周愛(ài)玉，何保山，羅金平，蔡新霞

　　(1．中國科學(xué)院電子學(xué)研究所 傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100080；2．中國科學(xué)院研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　細菌總數檢測是食品衛生學(xué)檢測領(lǐng)域的重要檢測指標，主要是用來(lái)判斷食品被污染的程度。對細菌總數進(jìn)行快速準確的檢測一直是該領(lǐng)域內重要的研究課題。對細菌總數進(jìn)行檢測的國標方法是平板計數法，需要將樣品用營(yíng)養瓊脂37℃培養48 h記數，測試時(shí)間長(cháng)，操作繁瑣，不適合現場(chǎng)檢測。ATP生物發(fā)光檢測方法具有檢測速度快、成本低、易于操作等特點(diǎn)，已引起眾多研究者關(guān)注。同時(shí)，因為ATP生物發(fā)光技術(shù)以生物體內的ATP作為檢測對象，不僅包括細菌，也包括體細胞在內的食品殘渣等食品污染物，因此適合在食品衛生檢測領(lǐng)域對衛生狀況進(jìn)行快速檢測。

　　使用ATP生物發(fā)光技術(shù)測量ATP最早見(jiàn)于1949年Mcelroy的報道。自此以后，ATP生物發(fā)光技術(shù)引起廣泛關(guān)注。本文在分析前人工作的基礎上，設計了一種ATP生物發(fā)光檢測儀，選擇光電倍增管(H5773-02，日本，濱松光子)作為光電轉換器件，其峰值響應波長(cháng)為500 nm，與反應所發(fā)熒光波長(cháng)基本一致，從而提高檢測靈敏度。本檢測儀采用自動(dòng)加樣技術(shù)，在加入被檢測樣品后，在反應腔內由自動(dòng)加樣裝置向檢測樣品池中自動(dòng)加入反應試劑，從而既避免了外界光的干擾，也有效地提高了加樣精度，從而提高了儀表的檢測可靠性及準確性。利用本檢測儀對10-6～10-14mol／L標準ATP樣品進(jìn)行了檢測，輸出信號與樣品濃度間的相關(guān)性達到0.986，可以滿(mǎn)足測量要求。

　　2 系統設計

　　2.1 檢測原理

　　ATP即三磷酸腺苷，是廣泛存在于生物體內的一種能量物質(zhì)。實(shí)驗證明，在生理條件下，每個(gè)細菌細胞中所含ATP的含量大致相同，約為10-18mol／個(gè)。螢火蟲(chóng)熒光素酶簡(jiǎn)稱(chēng)蟲(chóng)光素酶，是一種能將化學(xué)能轉變?yōu)楣饽艿幕钚缘鞍踪|(zhì)，即生物催化劑。ATP在蟲(chóng)光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及二價(jià)鎂離子作用下，反應釋放出熒光。當熒光素及蟲(chóng)光素酶過(guò)量情況下，釋放的熒光與ATP在一定范圍內成線(xiàn)性關(guān)系，因此可以通過(guò)測量熒光光強檢測樣品中的ATP，進(jìn)而檢測其中的細菌總數。

　　2.2 結構設計

　　本檢測儀的結構如圖1所示，主要包括三部分，分別為自動(dòng)進(jìn)樣單元、光電轉換單元和信號采集處理及控制單元。其中，自動(dòng)進(jìn)樣單元包括三套蠕動(dòng)泵(WX10，保定蘭格恒流泵有限公司)和試劑盒，分為獨立三路加樣通路，分別為體細胞裂解劑、細菌細胞裂解劑和熒光素一熒光素酶發(fā)光試劑。根據測試需要，蠕動(dòng)泵在控制單元控制下，向光電轉換單元中的樣品池加入對應反應試劑。光電轉換單元包括檢測樣品池和光電轉換器件。為消除外界光的干擾，整個(gè)光電轉換單元被密封在暗盒中。光電轉換器件將反應釋放熒光轉化為電信號，由信號采集處理單元采集并處理，并對測試結果進(jìn)行實(shí)時(shí)顯示和存儲。

　　2.3 電路設計

　　系統的電路結構如圖2所示。光電轉換器件將熒光信號轉換為電流信號，通過(guò)微處理芯片ADuC834(Analog Devices，美國)對信號進(jìn)行采集及處理。ADuC834同時(shí)作為控制核心，控制自動(dòng)加樣單元，顯示及存儲單元，并可將測量結果通過(guò)RS232接口上傳至上位機以進(jìn)行結果分析。

　　2.4 軟件設計

　　檢測儀表的操作軟件由C語(yǔ)言編寫(xiě)，軟件結構如圖3所示，共分三項功能模塊，分別為測量、記錄和儀表設置。其中，測量分為儀表獨立測量和連接電腦測量。儀表獨立測量時(shí)，微處理芯片ADuC834對一定時(shí)間內的信號采集并進(jìn)行積分處理，然后將測試結果實(shí)時(shí)顯示，根據用戶(hù)選擇也可將測試結果上傳至計算機；聯(lián)機測量時(shí)，ADuC834對所采集的信號不進(jìn)行處理，而是直接將其傳送到上位計算機中，并實(shí)時(shí)顯示時(shí)間響應曲線(xiàn)，方便用戶(hù)在計算機對所測數據進(jìn)行分析，適合于實(shí)驗室中的測試分析。記錄子菜單分為記錄查詢(xún)和記錄刪除，用以對記錄進(jìn)行操作。采用24LC256作為外部數據存儲芯片，本儀表設計可存儲測試結果200條，記錄查詢(xún)時(shí)可對逐條記錄進(jìn)行顯示；記錄刪除則分為逐條刪除和全部刪除；設置子菜單可實(shí)現儀表校準和倍增管電壓調整兩項功能。

　　3 實(shí)驗與結果

　　3.1 器件選取

　　由于A(yíng)TP生物發(fā)光所發(fā)光強較弱，因此本檢測儀選用高靈敏的光電倍增管作為光電轉換器件。利用F-4500熒光分光光度計(日本，日立)對ATP生物發(fā)光反應所發(fā)熒光波長(cháng)進(jìn)行掃描，峰值波長(cháng)約為550 nm。為保證檢測具有更高靈敏度，所選光電倍增管的響應波長(cháng)應與熒光波長(cháng)一致。日本濱松光子的H5773-02型光電倍增管的響應波長(cháng)為330～850 nm，峰值檢測波長(cháng)在500～600 nm基本保持恒定，因此符合本系統設計要求。

　　3.2 結果與討論

　　實(shí)驗選擇標準ATP樣品作為檢測對象，濃度范圍為10-6～10-14mol／L，實(shí)驗中所用熒光素及熒光素酶購自美國普洛麥格公司。實(shí)驗采用聯(lián)機測量方式，將本檢測儀與計算機通過(guò)。RS232接口相連接，儀表信號采集單元采集熒光信號后直接上傳至計算機并將測試結果實(shí)時(shí)顯示。測量結果如圖4所示。

　　在反應中，加入發(fā)光反應試劑時(shí)，體系中樣品濃度相對較高，因此在短時(shí)間內即迅速反應釋放大量熒光，此時(shí)熒光光強較強，因此測量結果可能會(huì )超出系統的測試量程。由于本儀表的最大輸出電壓為2500 mV，反應初期釋放的熒光可能會(huì )超出該范圍，在圖中表現為前端的水平直線(xiàn)。隨著(zhù)反應進(jìn)行，體系中樣品和試劑的濃度逐漸降低，所釋放熒光隨之逐漸衰減。由圖可見(jiàn)，不同樣品濃度的ATP隨反應進(jìn)行，進(jìn)入測量量程的時(shí)間不同，濃度越高，衰減越慢，進(jìn)入測量量程的時(shí)間越長(cháng)，反之越短。對圖4中各響應曲線(xiàn)400 s內的測量值進(jìn)行積分，作為各濃度樣品的輸出信號。輸出信號與濃度的關(guān)系如圖5所示。由圖可以看出，輸出信號隨濃度增加而增加，且有明顯梯度，兩者的線(xiàn)性相關(guān)系數達到0.986。這一結果說(shuō)明本檢測系統可以對ATP濃度進(jìn)行快速檢測。由于細菌細胞中所含ATP含量基本一致，因此，本檢測儀可實(shí)現對細菌總數的現場(chǎng)快速檢測。

　　4 結 論

　　本文針對細菌總數檢測需求，設計了一種基于A(yíng)TP生物發(fā)光技術(shù)的細菌總數快速檢測儀。該檢測儀在對現有產(chǎn)品進(jìn)行分析的基礎上，選擇H5773-02光電倍增管作為光電轉換器件，其檢測波長(cháng)與生物發(fā)光反應所釋放熒光波長(cháng)一致，可有效提高檢測靈敏度。采用自動(dòng)加樣技術(shù)，在暗室內加入發(fā)光反應試劑，消除了外界光的干擾，且獲得了反應最初的信號。本文以細菌檢測的中間產(chǎn)物標準ATP溶液作為檢測對象，對所設計的檢測儀進(jìn)行測試。將檢測儀與計算機連接測量，獲得了各反應所釋放熒光強度的時(shí)間響應曲線(xiàn)。在此基礎上，對響應曲線(xiàn)400 s內的值進(jìn)行積分，作為對應樣品濃度的輸出信號，得到了輸出電壓與濃度的關(guān)系曲線(xiàn)，兩者的線(xiàn)性相關(guān)系數達到0.986，可滿(mǎn)足測試要求。本文所設計的針對細菌總數的檢測儀具有檢測速度快、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單、小型便攜等特點(diǎn)，在口岸、衛生監管部門(mén)、食品生產(chǎn)部門(mén)等對產(chǎn)品、環(huán)境等的衛生狀況進(jìn)行現場(chǎng)快速檢測領(lǐng)域具有很好的應用前景。