現場(chǎng)檢測用谷丙轉氨酶光學(xué)生物傳感器研究

　　何保山，周愛(ài)玉，李華清，岳偉偉，羅金平，蔡新霞

　　(1.中國科學(xué)院 電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100080；2.中國科學(xué)院 研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　ALT也稱(chēng)作丙胺酸氨基轉移酶，廣泛存在于機體內各器官組織中。在肝、心、腎、胰、腦、肺、肌肉、骨骼等器官組織細胞中，都含有不同程度的ALT，但以肝臟含量為最多，存在于肝細胞漿中。ALT主要代謝功能是可以催化丙胺酸和α-酮戊二酸可逆轉換成丙酮酸和谷氨酸。當肝細胞受損時(shí)，大量的ALT就會(huì )釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統中，升高的ALT酶活被認為是肝細胞損傷的最特異性標志物之一。

　　我國衛生部規定，血清ALT檢驗足獻血員健康體檢必查項目之一，同時(shí)規定獻血者的血液ALT檢測方法采用賴(lài)氏法或全自動(dòng)生化儀的速率法。但這兩種方法存在的主要問(wèn)題是賴(lài)氏法耗時(shí)長(cháng)，準確性差，受主觀(guān)因素影響大。而速率法雖然準確，但儀器龐大，價(jià)格昂貴，需專(zhuān)業(yè)人士操作。面對現在街頭無(wú)償獻血者因血清ALT高造成大量不必要的獻血和血液浪費問(wèn)題，非常有必要建立一種快速靈敏、準確方便的ALT檢測方法，這將對開(kāi)展血清中ALT研究和“窗口期”肝炎預防具有非常重要的現實(shí)意義。

　　基于光的吸收／反射原理和酶促反應原理，本文介紹了一種新型的谷丙轉氨酶光學(xué)生物傳感器，將反應底物和指示劑依次固定在敏感膜中制作成生物傳感器，這種傳感器可以用于血清ALT的快速檢測，制作簡(jiǎn)單，成本低，適于一次性使用，在血液篩查方面具有良好的應用前景。

　　2 實(shí)驗部分

　　2.1 試劑

　　丙胺酸、α-酮戊二酸、谷丙轉胺酶(ALT，EC2.6.1.2，from porcine heart，84 U／mg)、丙酮酸氧化酶(PyOD，EC1.2.3.3，8.9 U／mg)、磷酸緩沖鹽片(PBS，0.01 mol／L，pH 7.4)購自美國Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶(POD，EC1.11.1.7，fromGrade I，horseradish，250 U／mg)購自德國Roche公司；3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、硫酸鎂、磷酸鈉購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純，溶液皆用去離子水配制，最終調節溶液pH值為7.4。實(shí)驗在室溫下進(jìn)行。

　　血清樣本由北京醫院臨床檢驗中心和北京市紅十字血液中心提供。

　　2.2 檢測原理

　　利用光的吸收／反射原理塒血清中ALT進(jìn)行快速檢測。首先血清中ALT催化丙胺酸和α-酮戊二酸轉化生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸在磷酸根和丙酬酸氧化酶的作用下氧化生成乙酰磷酸和過(guò)氧化氫，生成的過(guò)氧化氫具有強氧化性，可以將還原性的指示劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)氧化生成藍色化合物，致使敏感膜發(fā)生顏色變化。敏感膜顏色的深淺與過(guò)氧化氫的量直接相關(guān)，而過(guò)氧化氫又只與樣本中ALT的含量相關(guān)，因此通過(guò)光分析系統靈敏感知敏感膜顏色的變化即可得知樣本中ALT的含量，反應原理為

　　2.3 ALT光學(xué)生物傳感器的制備

　　本新型光學(xué)生物傳感器由敏感膜、保護膜和基底三部分組成，分別由劃片機切割成所需尺寸，用粘合劑粘結成形(如圖1所示)。其中敏感膜用配好的反應試劑和指示劑先后滴加其上，置于室溫風(fēng)干，最后封蓋透明保護膜即可備用。

　　2.4 傳感器系統組成及測量方法

　　圖2為傳感器系統組成的框圖。以帶有數據傳輸接口的微處理器為中樞，通過(guò)數模接口向SP62光源發(fā)送調制信號?？刂乒庠丛陬A定的條件下啟動(dòng)，通過(guò)模數接口自動(dòng)讀取特定波長(cháng)下的光信號，并即時(shí)顯示數據結果。

　　測試時(shí)取血清試樣10 μL滴加在敏感膜的中央，啟動(dòng)儀器檢測，同時(shí)計時(shí)開(kāi)始，待試樣擴散均勻后，封蓋透明保護膜，將傳感器插入測試儀器，約60 s，自動(dòng)讀取光信號值，依據預先置入的反射值與ALT濃度的響應關(guān)系，即可定量檢測血清中ALT的含量。

　　3 結果與討論

　　圖3所示的是不同濃度ALT在可見(jiàn)光區域內的全波長(cháng)掃描圖。其中a，b，c，d，e對應的ALT濃度分別為1000，500，250，100，25 U／L。由圖中可以看出，當傳感器加入ALT后，波長(cháng)為400～700nm，生成的藍色產(chǎn)物在波長(cháng)660 nm處出現了特異性的吸收，并且隨著(zhù)ALT濃度N的增加，傳感器敏感膜藍色加深，光吸收增強，波長(cháng)660 nm處反射值逐漸降低，這說(shuō)明本光學(xué)生物傳感器在660 nm處分辨率最好，靈敏度也最高，這與監色物質(zhì)對白光的吸收／反射特性是一致的。

　　實(shí)驗表明樣本中ALT濃度N和波長(cháng)660 nm處反射值是線(xiàn)性相關(guān)的。圖4是利用ALT光學(xué)生物傳感器檢測人體血清的響應關(guān)系圖。血清樣本由北京市紅十字血液中心提供，在20～150 U／L均勻選擇6個(gè)樣本，每個(gè)樣本測試3次，檢測時(shí)間60 s。實(shí)驗發(fā)現，在20～150 U／L內，血清ALT濃度N和反射值表現出較好的線(xiàn)性關(guān)系y=0.0372x+66.055，R=0.987，線(xiàn)性相關(guān)系數為0.987，可以實(shí)現對血清ALT的現場(chǎng)快速檢測。

　　4 結 論

　　盡管對患有肝病病人的診斷中ALT具有非常重要的臨床意義，但很少有可用于肝病現場(chǎng)快速診斷的傳感器出現。2003年，G．S．Xuan等人報道了一種固定有ALT抗體的電化學(xué)免疫傳感器，雖然此傳感器系統對ALT表現出優(yōu)良的檢測速度和精度，但它的形式結構卻比較復雜，檢測上限受到抗體特性的限制。本文基于光的吸收／反射原理和酶促反應原理提供了一種新型的ALT光學(xué)生物傳感器，反應底物和指示劑依次固定在敏感膜中制作成生物傳感器，其血清ALT檢測時(shí)間60 s，檢測范圍20～150 U／L，線(xiàn)性相關(guān)系數為0.987。并且這種生物傳感器制作簡(jiǎn)單，耗樣少(10 μL)，一次性使用，避免交叉感染，具有良好的臨床醫學(xué)應用前景。